高效液相色譜法測定運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中黃曲霉毒素M1方法研究

戴云華 祁奇

摘 要：目的：建立運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中黃曲霉毒素M1的HPLC的檢測方法。方法：樣品經(jīng)提取、過免疫親和柱凈化，再氮吹復(fù)溶后用高效液相色譜法測定其中黃曲霉毒素M1的含量。結(jié)果：黃曲霉毒素M1在0.05～5.00 ng/mL線性良好，回歸方程Y=34 616X-68.307，相關(guān)系數(shù)R2=1，平均回收率為96.78%，檢出限為0.07 μg/kg。結(jié)論：該試驗(yàn)所用方法簡單方便，重現(xiàn)性較好，回收率較好，精密度良好，可用于運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中黃曲霉毒素M1含量的測定。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品;黃曲霉毒素M1;液相色譜

Determination of Aflatoxin M1 in Sports Nutrition Food

by HPLC DAI Yunhua， QI Qi

（Changzhou Food and Drug Fiber Quality Supervision and Inspection Center， Changzhou 213000， China）

Abstract： Objective： An HPLC method for the detection of aflatoxin M1 in sports nutrition food was established. Method： The samples were extracted， purified by immunoaffinity column， reconstituted by nitrogen blowing， and the content of aflatoxin M1 was determined by high performance liquid chromatography. Result： The linearity of aflatoxin M1 was good in the range of 0.05～5.00 ng/mL， the regression equation was Y=34 616X-68.307， the correlation coefficient R2=1， the average recovery was 96.78%， and the detection limit was 0.07 μg/kg. Conclusion： The method used in this experiment is simple and convenient， with good reproducibility， good recovery rate and good precision， and can be used for the determination of aflatoxin M1 in sports nutrition food.

Keywords： sports nutrition food; aflatoxin M1; liquid chromatography

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，是曲霉菌等菌類的高毒代物。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）定為Ⅰ類致癌物，能使人體或動(dòng)物的免疫功能喪失，誘導(dǎo)畸形、癌癥的發(fā)生[1]。黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1相當(dāng)，因此含有黃曲霉毒素M1的牛奶危害很大[2]。多數(shù)政府機(jī)構(gòu)都對(duì)人體和動(dòng)物可攝入的黃曲霉毒素量有嚴(yán)格的法規(guī)限制。很多國家已經(jīng)對(duì)牛奶和乳制品中的黃曲霉毒素M1含量有了明確的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]。

運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品是為滿足運(yùn)動(dòng)人群的生理代謝狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)能力及對(duì)某些營養(yǎng)成分的特殊需求而專門加工的食品。為了滿足營養(yǎng)補(bǔ)給，一般的代餐和蛋白棒中的主蛋白粉基本是濃縮乳清蛋白粉、濃縮牛奶蛋白粉等。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了乳及乳制品、含乳特殊膳食用食品、運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品等各類別中AFM1的限量，但在《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）中并沒有涉及到運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中AFM1的檢測方法。本文通過甲醇提取，由免疫親和柱凈化為前處理手段，氮吹復(fù)溶后通過液相色譜熒光檢測器檢測，建立了操作簡單、靈敏度高、可廣泛推廣的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.3 μg/mL），浙江農(nóng)科院;黃曲霉毒素M1免疫親和柱，上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司;甲醇、乙腈，默克股份兩合公司;乳清蛋白棒，杭州衡美食品科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20ADXR高效液相色譜儀（帶熒光檢測器），島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司;Waters Symmetry C18色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司;FOTECTOR PLUS全自動(dòng)固相萃取儀，睿科集團(tuán)股份有限公司;CP513電子天平（千分之一），奧豪斯儀器（常州）有限公司;高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司;TurboVap LV氮吹儀，拜泰齊貿(mào)易（上海）有限公司;渦旋儀，德國IKA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液（10.3 μg/mL）用乙腈稀釋成40 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液12.5 μL、25.0 μL、50.0 μL、125.0 μL、250.0 μL、500.0 μL及1 250.0 μL至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，配制成0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A：甲醇+乙腈（1∶1），流動(dòng)相B：水;流速：1.0 mL/min;柱溫：40 ℃;熒光檢測波長：激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長430 nm;進(jìn)樣體積：50 μL。

1.3.3 樣品前處理

（1）提取。稱取1 g粉碎均勻的乳清蛋白棒（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入4 mL 50 ℃熱水渦旋混勻。加入10 mL甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下離心10 min。用玻璃纖維濾紙過濾至澄清。移取4.0 mL樣品提取液至50 mL離心管中，用40 mL水稀釋，混勻備用。

（2）凈化。將上述樣液以約1 mL/min的速度注入免疫親和柱內(nèi)，帶樣液滴完后，用10 mL水淋洗親和柱，真空抽干親和柱，然后用2 mL甲醇以1 mL/min的速度洗脫，收集全部洗脫液至刻度試管中。該步驟用了兩種方法：①固相萃取儀，在設(shè)置凈化方法時(shí)需注意上樣的速度，上樣后需清洗注射器，淋洗速度也要慢;②手動(dòng)過柱，同樣需要注意上樣和淋洗的速度，經(jīng)比對(duì)，回收率相差不大。固相萃取儀更方便，效率高。

（3）氮吹復(fù)溶。在50 ℃下氮?dú)饩従彽貙⑸鲜鱿疵撘捍抵良s0.5 mL，加入流動(dòng)相復(fù)溶定容至1 mL，渦旋30 s溶解殘留物，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜儀分析。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。注意氮吹時(shí)不能吹干，以免造成AFM1的流失。復(fù)溶后要混勻。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢驗(yàn)，空白實(shí)驗(yàn)和樣品乳清蛋白棒中的黃曲霉毒素M1均為陰性。黃曲霉毒素M1標(biāo)樣的液相色譜圖見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

配制的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度為0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL，以黃曲霉毒素M1濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=34 616X-68.307，R2=1。見圖2。

2.3 檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液稀釋成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為0.10 ng/mL、0.07 ng/mL、0.05 ng/mL和0.02 ng/mL，并進(jìn)樣分析，以3倍信噪比作為檢出限，得出黃曲霉毒素M1的檢出限為0.07 μg/kg。

2.4 精密度

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 ng/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果分別為0.980 ng/mL、0.977 ng/mL、0.986 ng/mL、0.988 ng/mL、0.978 ng/mL及0.979 ng/mL，黃曲霉毒素M1的RSD值為0.463%，表示精密度良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取試樣加標(biāo)（加入濃度為3.5 ng/mL的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL），換算值為0.35 μg/kg，按照上述檢驗(yàn)方法檢測分析，測定6平行，結(jié)果分別為0.339 6 μg/kg、0.332 8 μg/kg、0.336 0 μg/kg、0.346 6 μg/kg、0.329 2 μg/kg及0.336 1 μg/kg，黃曲霉毒素M1的RSD為1.78%，可見重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意。

2.6 回收率試驗(yàn)

取樣品（樣品空白顯示陰性）1 g，加入濃度為3.5 ng/mL的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL（換算值為0.175 μg/kg、0.350 μg/kg、1.750 μg/kg），檢測結(jié)果見表1，平均回收率為96.78%，從而可以看出此方法可以滿足檢測要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述的重復(fù)性試驗(yàn)用試樣，6 h進(jìn)樣一次分析，記錄峰面積，結(jié)果顯示，在24 h之內(nèi)，峰面積相差不大，判定黃曲霉毒素M1的化學(xué)性質(zhì)基本穩(wěn)定。

3 結(jié)果與討論

該研究方法基于免疫親和柱對(duì)黃曲霉毒素吸附的專一性，在原始的HPLC方法上加以優(yōu)化改進(jìn)，找到最合適的凈化和分離條件，利用HPLC的良好分離效果，達(dá)到了靈敏、準(zhǔn)確的檢測效果[4]。原標(biāo)準(zhǔn)中洗脫用的是4 mL乙腈，再氮?dú)獯抵两桑译嫦鄬?duì)來說毒性比較大，氮吹至干的操作會(huì)直接影響最終測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。經(jīng)研究證明，用2 mL甲醇進(jìn)行洗脫即可將黃曲霉毒素M1洗脫完全，氮吹也不能吹干，控制在0.5 mL左右，復(fù)溶至1 mL，結(jié)果證明測定結(jié)果較準(zhǔn)確，回收率較高。本文建立了測定運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中黃曲霉毒素M1的高效液相色譜法，前處理并不復(fù)雜，熒光檢測器靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，回收率高，是可切實(shí)推廣的HPLC標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。

參考文獻(xiàn)

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作者簡介：戴云華（1985—），女，江蘇金壇人，本科，工程師。研究方向：食品檢驗(yàn)技術(shù)。

祁奇（1994—），男，江蘇連云港人，碩士，助理工程師。研究方向：食品檢驗(yàn)技術(shù)。