益腎化濕顆粒改善糖尿病小鼠早期腎小管損傷的實驗研究*

陳莉 ，安海燕 ，郭曉媛 ，張承承

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院腎病科，北京 100078）

糖尿病腎?。―KD）是糖尿?。―M）常見微血管并發癥之一，也是導致終末腎臟病（ESRD）的主要原因。近些年來，DM的發病率逐年升高，國際糖尿病聯合會根據既往調查研究統計2019年全球DM患病率約9.3%，到2030年估計將上升至10.2%，而至2045年可能將上升至10.9%，由DKD及相關并發癥的治療將給全球醫療保健系統帶來沉重的經濟負擔[1]，因此，對于DKD的早期干預與治療也越加受到重視。既往對DKD早期腎臟病理的認識均以腎小球損傷為主，但近些年來新的觀點認為腎小管損傷可能才是DKD早期蛋白尿形成的主要原因[2]。腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白是重吸收尿蛋白的主要結構，當兩者表達減少時可導致蛋白尿加重。尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）水平與白蛋白尿正相關，而與腎小球濾過率呈負相關，是腎小管損傷的標記物，并且是監測DKD很有前途的早期指標[3]。腎小管損傷是導致DKD患者腎功能下降的主要原因。目前中醫在治療DKD上的優勢越發凸顯，其中益腎化濕顆粒為近些年來新研發的中成藥，經相關研究證實在改善DKD患者腎功能及并發癥上療效顯著[4-5]。本研究主要觀察益腎化濕顆粒減輕db/db小鼠早期腎小管損傷，延緩DKD進展的作用，為臨床治療DKD提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 18只SPF級健康雄性db/db小鼠，6～7周齡，體質量（35～45）g；6只 SPF 級健康雄性db/m 小鼠，6～7 周齡，體質量（20～25）g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。所有動物飼養在北京中醫藥大學東方醫院實驗中心SPF級實驗動物屏障環境，溫度21～22℃，相對濕度60%～70%，24 h晝夜循環光環境，動物自由進食，自由飲水。飼料為普通清潔級大鼠維持飼料，購于北京科奧協力飼料有限公司。本實驗通過北京中醫藥大學東方醫院醫學實驗動物倫理委員會審查（201924）。

1.2 藥物 益腎化濕顆粒（廣州康臣藥業有限公司，批號：國藥準字Z20090250）；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號：國藥準字H20040217）。

1.3 試劑及儀器 4%多聚甲醛（歐北生物科技有限公司）；兔抗megalin多克隆抗體（美國Proteintech Group公司）；羊抗cubilin多克隆抗體（美國R&D Systems公司）；NGAL酶聯免疫吸附測定試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）；尿蛋白（UTP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）檢測試劑（英科新創科技有限公司）；PAS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。AU480型全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）；切片機（上海徠卡儀器有限公司）；多功能酶標儀（Thermo）；電熱恒溫培養箱（天津泰斯特DH4000A）；MH-1微孔板震蕩器（kylin-Bell）；洗板機（Thermo）；普通光學顯微鏡（Olympus L340099）；成像系統（日本尼康Nikon DS-U3）。

1.4 分組及干預 所有小鼠適應性喂養1周后將18只自發型2型糖尿病db/db小鼠隨機分為模型組、纈沙坦組、益腎化濕組，每組6只，另設雄性db/m小鼠6只為正常對照組。

纈沙坦膠囊及益腎化濕顆粒均以去離子水充分攪拌混勻，4℃冰箱保存藥物，灌胃前將藥物從冰箱取出置于溫水中水浴至藥物溫度適中后再行灌胃，對照組及模型組予去離子水[10 mL/（kg·d）]灌胃。纈沙坦組予纈沙坦膠囊[（生藥13.33 mg/（kg·d）]灌胃，益腎化濕組予益腎化濕顆粒[（生藥5 g/（kg·d）]灌胃（約等于人體推薦劑量的 10 倍）[6]，連續干預12周。由于灌胃過程操作失誤，中藥組小鼠死亡1只。

藥物干預12周后代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，-20℃冰箱保存，備用24 h-UTP及NGAL檢測。采用1%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）將小鼠麻醉后取血，備用血液生化檢測。取血后處死小鼠，腎組織以4%多聚甲醛固定后備用PAS染色及免疫組化檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 血清生化指標檢測 血液標本靜置2 h后，4℃、3 000 r/min、20 min離心提取血清，-80℃冰箱保存，全自動生化分析儀檢測Scr、BUN、UA、TG、LDL水平。

1.5.2 24 h-UTP及尿NGAL水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測24 h-UTP水平；ELISA法檢測尿液NGAL水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 腎組織PAS染色 小鼠腎組織固定后脫水，石蠟切片置于60℃烤箱烘片30 min，分別用二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化，行PAS染色，400倍鏡下拍片。結果判定：采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統進行PAS染色分析，每張切片選6個視野，計算腎小球系膜和基底膜相對面積，取平均值。腎小球系膜基質指數=PAS陽性染色面積/腎小球毛細血管袢總面積×100%[7]。

1.5.4 腎組織megalin、cubilin免疫組化染色 小鼠腎組織固定后脫水，石蠟切片脫蠟、水化，3%過氧化氫孵育10 min滅活過氧化氫酶，枸櫞酸緩沖液修復抗原，5%牛血清白蛋白封閉，分別加入一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍后脫水封片，200倍鏡下進行拍片，結果判定：陽性表達部分呈棕黃色顆粒狀，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對每張圖片選中區域進行IOD（sum）及 Area（sum）采集，然后以 IOD（sum）/Area（sum）得到每張圖片的平均光密度值，每例切片測定5個非重復視野，結果取平均值。

1.6 統計方法 采用SPSS 20.0進行數據分析，計量數據以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時，則采用Tamhance’s T2檢驗，數據不符合正態分布則采用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 益腎化濕顆粒對小鼠血液生化指標的影響 與正常組比較，模型組小鼠血液UA、TG及LDL水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.01），BUN、Scr水平無明顯變化，差異無統計學意義。與模型組比較，纈沙坦組小鼠LDL水平下降，差異具有統計學意義（P＜0.01），益腎化濕組小鼠UA、LDL水平下降，差異具有統計學意義（P＜0.05），益腎化濕組小鼠血液TG水平有下降趨勢，但無統計學意義，見表1。

表1 各組小鼠生化指標比較（±s）

表1 各組小鼠生化指標比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組動物數BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）UA（μmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）正常組 6 7.90±0.90 19.50±0.84 136.50± 24.53 0.28±0.06 0.18±0.03模型組 6 8.71±2.17 20.83±2.78 314.00±103.41** 0.86±0.44** 0.63±0.29**纈沙坦組 6 8.06±1.92 18.00±2.68 285.50± 92.21 0.83±0.33 0.29±0.11##益腎化濕組 5 7.97±3.16 19.40±3.13 177.80± 48.40# 0.66±0.23 0.34±0.20#

2.2 益腎化濕顆粒對小鼠24 h-UTP及尿液NGAL的影響 與正常組比較，模型組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，纈沙坦組及益腎化濕組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平有不同程度下降，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見表 2。

表2 各組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平比較（±s）

表2 各組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組 動物數 24 h-UTP（mg） NGAL（pg/mL）正常組 6 16.84± 9.51 4 944.08±1 485.27模型組 6 63.49±22.29** 8 053.05±1 103.24**纈沙坦組 6 30.82±12.29## 5 622.89±1 839.29#益腎化濕組 5 39.09± 9.82# 4 351.47±1 465.94##

2.3 益腎化濕顆粒對小鼠腎臟病理的影響 PAS染色提示，正常組小鼠腎小球結構正常，毛細血管清晰，基底膜均勻，未見明顯系膜基質增生；模型組小鼠較正常組小鼠腎小囊腔狹窄，腎小球毛細血管腔不明顯，系膜區明顯增寬，系膜基質增生，腎小管管腔不規則，部分腎小管刷狀緣丟失；纈沙坦組小鼠腎小球毛細血管清晰，基底膜稍增厚，局部系膜基質增生，可見紫紅色糖原物質沉積，部分腎小管管腔不規則；益腎化濕組小鼠系膜基質增生不明顯，腎小球毛細血管腔明顯，腎小管排列規整，刷狀緣較完整，見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織PAS染色

Imagepro Plus 6.0軟件統計，與正常組比較，模型組小鼠腎小球系膜基質指數升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組和益腎化濕組腎小球系膜基質指數下降，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖 2。

圖2 各組小鼠腎小球系膜基質指數分析比較（±s）

2.4 益腎化濕顆粒對小鼠腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白表達的影響 正常組小鼠腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白均大量表達，主要表達在近端腎小管胞漿內。與正常組比較，模型組小鼠腎組織 megalin、cubilin表達下降，Imagepro Plus 6.0軟件統計megalin、cubilin平均光密度值下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組及益腎化濕組小鼠腎小管上皮細胞megalin、cubilin表達增加，Imagepro Plus 6.0 統計平均光密度值有不同程度升高，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖 3、圖 4。

圖3 各組小鼠腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白的表達

圖4 各組小鼠腎小管megalin、cubilin表達的平均光密度值分析比較（±s）

3 討論

DKD主要以蛋白尿及腎功能下降導致的相關臨床癥狀為主，中醫多將之歸于“下消”“尿濁”“濁毒”“水腫”“關格”等范疇。對于DKD的病因病機認識，《靈樞·本臟》曰：“脾脆……善病消渴。”《外臺秘要·消渴消中》云：“消渴者，原其發動，此則腎虛所致，每發即小便至甜?！薄额愖C治裁·三消論治》曰：“小水不臭反甜者，此脾氣下脫?！笨梢姳静“l生發展與脾腎兩臟關系密切。腎主藏精，腎虛精失固攝，下泄形成蛋白尿。脾主運化，通過脾升胃降使機體氣機升降有序，水液正常輸布至全身，若脾胃虛弱則易導致水液停滯，濕邪釀生，脾的生理特性喜燥惡濕，濕邪貫穿于DKD病程始終，濕邪可以反過來困遏脾陽，導致脾氣不升，加重水液運化功能障礙，濕性黏滯致病情纏綿難愈，反復發作，故治療DKD時應當重視健脾益腎，升陽除濕。

益腎化濕顆粒原方出自李東垣《脾胃論》中的名方“升陽益胃湯”，由人參、黃芪、白術、茯苓、陳皮、炙甘草、柴胡、獨活、羌活、防風、澤瀉、黃連、白芍等16味中藥組成，方中人參、白術、茯苓、炙甘草、陳皮、半夏取自六君子湯，為益氣健脾、燥濕化痰之代表方；黃芪為補氣之圣藥，五臟并補，還具有行水消腫的功效；柴胡、獨活、羌活、防風為祛風藥，味薄氣輕而升散之力強，黃連清熱燥濕，澤瀉祛下焦濕濁，導濕熱從小便排出，諸藥合用，有補有瀉，具有升陽健脾，化濕清熱的功效。在此方中并無直接益腎的藥物，但卻以“益腎”為名，是基于脾腎兩臟之間的關系，通過補益脾胃，清化水濕之邪，使后天水谷精微之氣化生有源，從而得以不斷充盈先天，故能“益腎”。

目前，早期DKD損傷機制和治療靶點的研究已由以腎小球損傷為中心轉移到“糖尿病腎小管?。―T）”研究[8]。因此，腎小管損傷的防治研究具有重要的臨床意義。此外，國內外對小鼠進入早期DKD階段的判斷尚無明確標準，但基于對db/db小鼠腎臟病理特點的研究發現該小鼠一般不會發展至腎小球硬化和腎功能進行性下降的階段，因此廣泛用于研究早期DKD病變[9]。本實驗中db/db小鼠24 h-UTP水平較正常組小鼠明顯升高，系膜基質增生，腎小管刷狀緣丟失，伴有血UA及血脂水平的升高，而益腎化濕顆粒干預后可以有效降低24 h-UTP，緩解DKD系膜增生及小管病變，減輕db/db小鼠腎損傷，并且具有降低血UA和LDL水平的作用，提示益腎化濕顆?？梢酝ㄟ^改善DKD并發癥起到延緩疾病進展的作用。

NGAL是一種分子質量約25KD的脂質轉運蛋白，主要由包括中性粒細胞及腎小管上皮細胞在內的各種上皮細胞釋放，其一般在正常人體內保持著極低的水平，但是當近端腎小管損傷時，其水平可顯著增加[10-11]，相關研究表明在DKD患者中，尿液NGAL水平與腎小管間質損傷程度相關，可以作為腎小管損傷標志物[12]。本實驗模型組小鼠尿液NGAL水平水平較正常組小鼠明顯升高，提示存在腎小管損傷，經益腎化濕顆粒干預后db/db小鼠尿液NGAL水平明顯下降，說明藥物可以有效保護腎小管。

Megalin和cubilin同屬低密度脂蛋白受體家族成員，在近端腎小管上皮細胞中可見到這兩種蛋白受體的大量表達，并通過胞吞作用介導腎小管重吸收尿蛋白的過程，當腎小管上megalin、cubilin缺失時可以導致顯著的蛋白尿生成[13]。DKD早期就可以出現megalin、cubilin的表達減少，并且隨病程進展，這兩種蛋白的表達情況更進一步下降。Peruchetti等[14]利用高糖刺激腎小管上皮細胞，發現培育48 h后megalin表達明顯減少，Giraud-Billoud等[15]對糖尿病小鼠進行觀察亦發現其腎皮質上megalin、cubilin蛋白表達明顯減少，而尿白蛋白水平明顯升高，此外，多項實驗結果表明這種改變很早就已經發生[16-17]。因此，megalin、cubilin也可以反映 DKD 進程中的腎小管損傷。本研究發現db/db小鼠較db/m小鼠腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白表達明顯減少并出現明顯蛋白尿，提示megalin、cubilin蛋白表達減少可能是db/db小鼠早期蛋白尿形成的主要原因。經益腎化濕顆粒干預后，與模型組比較，db/db小鼠腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白表達明顯增加，說明益腎化濕顆?？赡芡ㄟ^上調megalin、cubilin蛋白的表達從而減少尿蛋白的形成，可以在一定程度上緩解db/db小鼠早期腎小管損傷。

積極防治腎小管損傷對于延緩DKD病情具有重要意義，益腎化濕顆?？梢越档蚫b/db小鼠24 h-UTP，改善腎臟病理損傷，其作用可能與上調腎小管上皮細胞megalin、cubilin蛋白的表達，下調尿液NGAL水平，減輕早期腎小管損傷有關，但是對于其具體作用機制仍需進一步的研究。