女貞子中5種環烯醚萜苷類成分的降解動力學研究*

劉媚琪 ，邱紫瑩，王冬萍 ，任曉亮 ，王萌 ，孫立麗

（1.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；2.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果實，味甘、苦，性涼，主要含有苯乙醇苷類、環烯醚萜類、三萜類、黃酮類、蒽醌類、多糖類以及揮發油等化學成分[1-2]，現代藥理研究表明女貞子或其提取物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗骨質疏松以及降糖、降脂等藥理作用[3-5]。其用藥歷史悠久，是常見的補氣疏肝、滋陰補腎中藥。女貞子是出自《扶壽精方》的經典名方二至丸中的藥材之一[6]，用于治療或緩解視力模糊、須發早白、大便郁結、骨質疏松、腰膝酸軟等癥狀[7-10]。含有女貞子的中成藥很多，臨床上應用廣泛，且涵蓋多種劑型，如片劑、丸劑、顆粒劑等[11]，由于其緩解防治的用藥特點以及滋養肝腎、益精補虛的藥用功效，患者可能需要很長一段時間服用該藥，而患者長時間存放或者攜帶過程中很可能受環境因素影響而使其有效成分發生降解甚至影響藥效。

課題組前期研究發現含有女貞子的成方制劑二至丸中部分藥效成分容易受到物理或化學環境的影響而發生降解[12]。環烯醚萜苷類成分是女貞子的主要活性成分之一，具有多種藥理活性，但由于其中含有酯鍵和糖苷鍵等結構，性質并不穩定，易于發生水解，這是否會影響女貞子的質量及藥效尚不可知，而且此類成分在女貞子中含量較高，但是目前對此類成分穩定性的研究尚未見報道。

本研究采用化學反應動力學方法系統研究了女貞子中5種環烯醚萜苷類成分在多種物理、化學環境下的降解規律，預期為女貞子藥材以及含女貞子的藥物制劑的儲存、應用及開發提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗儀器 Acquity H-class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；DELTA 320 pH儀（瑞士Mettler Toledo公司）；X224ZH十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；AHH-2數顯恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 橄欖苦苷對照品（純度＞98%，批號CHB180620，成都克洛瑪生物科技有限公司）；木樨欖苷-11-甲酯對照品（純度＞98%，批號YL2012121，上海一林生物科技有限公司）；女貞酸對照品（純度＞98%，批號YL2014062102，上海一林生物科技有限公司）；女貞苷G13對照品（純度＞98%，批號YL2014062501，上海一林生物科技有限公司）；特女貞苷對照品（純度97.3%，批號111926，中國食品藥品檢定研究院）；甲酸（色譜純，美國ROE SCIENTIFICINC）；乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；鹽酸（分析純，天津化學試劑一廠）；3% H2O2（分析純，河北吉捷生物科技有限公司）；氫氧化鈉、氯化鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；氯化鐵、氯化亞鐵（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）。

2 方法和結果

2.1 溶液制備 精密稱取橄欖苦苷、女貞酸、女貞苷G13、特女貞苷和木樨欖苷-11-甲酯對照品各5.00 mg，用無水甲醇定容于5 mL棕色量瓶中，得到質量濃度為1.00 mg/mL的對照品儲備液，避光放于4℃冰箱保存。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相 A：0.1%甲酸水，流動相 B：乙腈；梯度洗脫（0～5 min，5%～15%B；5～15 min，15%～17%B；15～30 min，17%～34%B）；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL。

2.3 溫度對穩定性的影響

2.3.1 溫度穩定性實驗 分別量取“2.1”項下實驗方法配制的5種環烯醚萜苷成分樣品溶液200 μL并分別置于10 mL棕色量瓶中，用純水定容至刻度后，并置于不同溫度（37、60、80℃）環境下，得到不同溫度條件下的樣品溶液，分別進行超高液相色譜（UPLC）分析樣品溶液中對照品的初始濃度（C0）和不同時間的剩余濃度（Ct），結果根據動力學規律，以百分剩余濃度的對數[ln（Ct/C0）]對時間（t）進行線性擬合，繪制降解動力學曲線，計算5種活性成分在不同溫度下的降解速率常數k，并根據Arrhenius公式，以lnk對-1/T作圖（圖2），計算各成分的降解活化能Ea（公式1）。計算得到的5種環烯醚萜苷類活性成分在不同溫度下的降解速率方程、擬合系數、半衰期t0.5等相關參數見表1。

表1 女貞子中5種環烯醚萜苷類成分在不同溫度下降解參數

其中k為反應速率常數，A為指數前因子，Ea為活化能（J/mol），R為摩爾氣體常數（8.314 J/K/mol），T 為熱力學溫度（K）。

2.3.2 溫度穩定性結果 表1結果顯示5種單體降解規律均符合一級動力學過程，5種成分在25℃下的活化能均大于40 kJ/mol，表明5種環烯醚萜苷類成分在常溫下不易發生化學反應；且5種單體隨著溫度上升其降解速率常數k隨之增大，說明5種單體隨溫度升高其降解速率均明顯加快，可見各單體成分降解速率均受溫度影響，降解速率隨溫度升高明顯加大；由降解動力學曲線（圖1）可以更直觀地看出各單體隨溫度升高降解速率均明顯加快。

圖1 各單體成分在不同溫度下降解動力學曲線

2.4 pH對穩定性影響

2.4.1 pH穩定性實驗 分別量取“2.1”項下實驗方法配制的5種環烯醚萜苷成分樣品溶液200 μL于10 mL棕色量瓶中，并用配好的不同pH（3.0、5.0、6.2、8.0）溶液定容，得到不同pH條件下的樣品溶液，分別進行UPLC分析樣品溶液中對照品的初始濃度（C0）和不同時間的剩余濃度（Ct），結果根據動力學規律，以[ln（Ct/C0）]對時間（t）進行線性擬合，并分別繪制降解動力學曲線，如圖3所示，計算得到的5種環烯醚萜苷類活性成分在不同pH下的降解速率方程、擬合系數、半衰期t0.5等相關參數見表2。

表2 女貞子中5種環烯醚萜苷類成分在不同pH下降解參數

2.4.2 pH穩定性結果 由降解動力學曲線可看出，橄欖苦苷、木樨欖苷-11-甲酯、女貞苷G13、特女貞苷在強酸性和堿性的環境下均不如弱酸性或接近于中性條件下穩定，橄欖苦苷、女貞苷G13和特女貞苷半衰期在pH為5.0時最大，木樨欖苷-11-甲酯在pH為6.2時半衰期最長，最穩定；而女貞酸在酸性條件下穩定，隨pH增大其降解速率加快，其半衰期隨pH增大而減小。

圖2 各單體成分降解速率（lnk）與溫度（1/T）關系圖

圖3 各單體成分在不同pH下降解動力學曲線

2.5 光照對穩定性的影響

2.5.1 光照穩定性實驗 精密量取“2.1”項下實驗方法配制的5種環烯醚萜苷成分樣品溶液200 μL分別置于10 mL棕色量瓶中，用純水定容至刻度后，并將其分別置于黑暗避光、紫外燈（8.16×105lux）及日光燈（1.55×106lux）環境下，得到不同光照條件下的樣品溶液，分別進行UPLC分析，分析結果根據動力學規律，以[ln（Ct/C0）]對時間（t）進行線性擬合，并繪制降解動力學曲線，如圖4所示，并計算得到的5種環烯醚萜苷類活性成分在不同光照下的降解速率方程、擬合系數、半衰期t0.5等相關參數見表3。

表3 各單體成分在不同光照條件下的降解參數

2.5.2 光照穩定性結果 由圖4以及表3可以看出與避光黑暗相比，5種成分在日光燈和紫外燈照射下半衰期均縮短，說明紫外燈和日光燈均會不同程度的加速5種單體成分的降解，其中紫外燈對橄欖苦苷、女貞苷G13和特女貞苷的降解影響強于日光燈；而女貞酸和木樨欖苷-11-甲酯則對日光燈更為敏感，降解更為明顯。

圖4 各單體成分在不同光照環境中降解曲線

2.6 金屬離子對穩定性影響

2.6.1 金屬離子穩定性實驗 分別取“2.1”項下實驗方法配制5種環烯醚萜苷成分樣品溶液取200 μL分別置于10 mL棕色量瓶中，分別用超純水、0.10 mol/L Fe3+、Fe2+和 Na+的水溶液定容，得到不同離子環境下的樣品溶液，分別進行UPLC分析，以[ln（Ct/C0）]對時間（t）進行線性擬合，并分別繪制降解動力學曲線，如圖5所示，并計算得到的5種環烯醚萜苷類活性成分在不同金屬離子下的降解速率方程、擬合系數、半衰期t0.5等相關參數見表4。

圖5 各單體成分在不同金屬離子環境中降解曲線

2.6.2 金屬離子穩定性結果 由圖5以及表4可看出，5種成分在金屬離子環境中均會加快其降解，與水溶液相比，金屬離子環境下其半衰期明顯縮短，3種金屬離子對5種成分降解速率的影響程度均為 Fe3+＞Fe2+＞Na+。在 Fe3+環境下各成分降解速率變化明顯，各化合物降解半衰期均小于5 min，對5種化合物的穩定性影響顯著。

表4 各單體在不同金屬離子環境下的降解參數

3 結論與討論

環烯醚萜是萜類化合物中的單萜類成分，為蟻臭二醛的縮醛衍生物，其半縮醛結構不穩定，易水解或在酸性介質中發生重排。實驗結果表明，5種環烯醚萜苷類成分中穩定性受堿性條件影響較酸性條件更為明顯，特女貞苷、女貞苷G13、木樨欖苷-11-甲酯、橄欖苦苷均在中性條件下最穩定，堿性和酸性條件下有不同程度的降解；猜測女貞酸可能因其含有羧基的結構與其顯酸性的特質，其在酸性條件下穩定，在堿性條件下極易降解，隨pH增高降解速率加快；5種環烯醚萜苷類成分降解速率均不具備高溫穩定性，對溫度敏感，其降解速率均隨溫度升高而加快；與黑暗避光相比，紫外燈和日光燈長時間照射均會不同程度地加速5種環烯醚萜苷類成分的降解，其中橄欖苦苷在日光燈和紫外燈下降解均較快，猜測是其結構含有易斷裂的酯鍵和醚鍵吸收特定波長的光后發生斷裂所致；金屬離子對5種成分穩定性也均有影響，對5種成分降解速率影響程度 Fe3+＞Fe2+＞Na+。

本研究采用化學反應動力學方法系統研究了女貞子中5種環烯醚萜苷類成分在多種物理、化學環境下的降解規律，提示了此類藥材或制劑應在低溫、pH近中性環境儲存，且應避免用鐵器儲存，避免紫外燈和日光燈長時間照射，并控制溶劑中存在的金屬離子。本研究為女貞子中環烯醚萜苷類成分在體內的穩定性、藥代動力學和相關制劑研究提供了一定的實驗依據，但其降解是否會對女貞子以及成方制劑藥效產生影響還需進一步研究。