HPLC法同時(shí)測(cè)定經(jīng)典名方濟(jì)川煎中多成分的含量*

蔡楠 ，曹寧寧 ，張琬靖 ，裴帥 ，李曉璇 ，肖學(xué)鳳 ，劉昌孝

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410；3.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

經(jīng)典名方是指目前廣泛應(yīng)用、療效確切、具有明顯特色與優(yōu)勢(shì)的清代及清代以前醫(yī)藥典籍中所記載的方劑。2018年國家中醫(yī)藥管理局頒布了包括濟(jì)川煎的100首古代經(jīng)典名方[1]。濟(jì)川煎始載于明代張景岳《景岳全書》卷五十一[2]。云：“凡病涉虛損，而大便閉結(jié)不通，則硝、黃攻擊等劑必不可用，若勢(shì)有不得不通者，宜此主之。當(dāng)歸三、五錢，牛膝二錢，肉蓯蓉二、三錢，澤瀉一錢半，升麻五分、七分或一錢，枳殼一錢。水一盅半，煎七八分，食前服。”現(xiàn)代研究參考《中國科學(xué)技術(shù)史—度量衡卷》中記載明代的藥量折算，按照一錢約為3.73 g，一分約為0.373 g計(jì)算，一盅約為200 mL，且經(jīng)典名方古今劑量折算原則專家共識(shí)中指出煎七、八分指煎一盅的70%、80%[3]。故稱取當(dāng)歸 11.19 g，牛膝 7.46 g，肉蓯蓉 7.462 g，澤瀉 5.60 g，升麻 1.87 g，枳殼 3.73 g，加水300 mL，煮至140～160 mL，即得濟(jì)川煎煎液。

濟(jì)川煎由肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、澤瀉、枳殼、升麻6味中藥組成，方中肉蓯蓉溫腎助陽，潤腸通便，為君藥；當(dāng)歸補(bǔ)血潤燥，潤腸通便；牛膝補(bǔ)益肝腎，壯腰膝，性善下行，共為臣藥；枳殼破氣消積，化痰除滿而助通便；澤瀉滲利小便而泄腎濁，共為佐藥；升麻以升清陽，清陽升則濁陰自降，配合諸藥，以助通便之效，為使藥。諸藥合用，共奏溫腎益精，潤腸通便之功[4]。主治腎陽虛弱，精津不足證，如大便秘結(jié)，小便清長，腰膝酸軟，頭目眩暈，舌淡苔白，脈沉遲等[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，濟(jì)川煎具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、提高結(jié)腸動(dòng)力、調(diào)節(jié)胃腸激素等作用[6-7]。臨床常用于治療習(xí)慣性便秘、老年便秘、產(chǎn)后便秘等疾病，偏于腎虛津虧腸燥者[8-9]，療效確切。故被列入《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》所載方劑之一。

目前，關(guān)于濟(jì)川煎的研究主要集中臨床應(yīng)用等方面，而有關(guān)濟(jì)川煎的含量測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道。中藥質(zhì)量是中藥臨床安全有效的基礎(chǔ)[10]，因此，為更好地控制濟(jì)川煎的質(zhì)量，保證其藥效，本研究建立同時(shí)測(cè)定濟(jì)川煎中松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸含量的方法，為濟(jì)川煎的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-2030C高效液相色譜儀（包括LC-20AD二元泵，CTO-20AC柱溫箱，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，UV檢測(cè)器，LabSolutions工作站，日本島津公司）；KQ5200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD10002C電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司），XS105DU分析天平（美國METTLERTOLEDO公司）；TG16-WS高速離心機(jī)（湘儀CENCE公司）；LGJ-10F真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；SHI-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）；30E2煎藥砂鍋（潮州市潮安區(qū)康雅順電器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試劑與試藥 乙腈、甲醇，色譜級(jí)，美國Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；對(duì)照品毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201914，純度 95.2%）、松果菊苷對(duì)照品（批號(hào)：111670-201907，純度91.8%）、新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：111857-201804，純度99.4%）、柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201815，純度91.7%）、異阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：111698-201904，純度99.3%）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111737-201608，純度100%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

當(dāng)歸、牛膝、肉蓯蓉、澤瀉、升麻、枳殼經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張堅(jiān)副教授鑒定當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根；肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖；澤瀉為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥塊莖；升麻為毛茛科植物興安升麻Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.的干燥根莖；枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，以上飲片均符合2020版《中國藥典》項(xiàng)下要求。飲片產(chǎn)地及批號(hào)具體見表1。

表1 飲片產(chǎn)地及批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱定松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸適量，加50%乙腈制成濃度分別為51.84、36.00、112.2、9.80、208.00、148.00 μg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取 1、2、4、6、8、10 mL 儲(chǔ)備液置10 mL容量瓶中，加50%乙腈定容至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 濟(jì)川煎供試品溶液的制備 稱取肉蓯蓉7.46 g，當(dāng)歸 11.19 g，牛膝 7.46 g，澤瀉 5.60 g，枳殼3.73 g，升麻1.87 g，加水300 mL，浸泡后煎煮至160 mL，過濾，濾液冷凍干燥，得濟(jì)川煎干膏粉。精密稱取濟(jì)川煎干膏粉0.05 g，置10 mL容量瓶中，加50%乙腈超聲溶解并定容至刻度，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備 分別稱取缺肉蓯蓉、當(dāng)歸、枳殼、升麻的處方量飲片，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備肉蓯蓉陰性樣品、當(dāng)歸陰性樣品、枳殼陰性樣品、升麻陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Waters WAT054275 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，12%乙腈；3～20 min，12%～14%乙腈；20～35 min，14%～18%乙腈；35～55 min，18%～22%乙腈；55～60 min，22%～26%乙腈；60～70 min，26%～35%乙腈；檢測(cè)波長 310 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL；洗脫時(shí)間為85 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別吸取空白溶劑（50%乙腈）、混合對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液及濟(jì)川煎供試品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明濟(jì)川煎中各成分分離度均較好，且無陰性干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，分別吸取系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以對(duì)照品峰面積計(jì)算，松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸峰面積的RSD分別為0.83%、0.59%、0.89%、0.88%、0.66%、0.67%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別在 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸的峰面積，并計(jì)算得RSD分別為1.22%、1.03%、0.61%、0.56%、0.66%、1.88%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批濟(jì)川煎干膏粉，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份濟(jì)川煎供試品溶液。以“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸的峰面積，并計(jì)算得RSD分別為2.46%、1.78%、0.55%、0.59%、0.83%、1.16%，表明方法重復(fù)性好。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知成分含量的同一批濟(jì)川煎干膏粉0.05 g，精密稱定6份，分別按樣品-對(duì)照品（1∶1）的比例加入一定量的松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算濟(jì)川煎供試品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸的平均加樣回收率分別為100%、99.2%、99.0%、99.5%、99.4%、98.1%，RSD 分別為0.95%、0.36%、0.56%、0.92%、1.11%、2.42%。

2.4 濟(jì)川煎供試品中多成分含量測(cè)定 按處方量分別稱取上述飲片，采用“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份濟(jì)川煎供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算濟(jì)川煎供試品中松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷及異阿魏酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 濟(jì)川煎供試品中多指標(biāo)成分的含量

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的確認(rèn) 經(jīng)典名方的化學(xué)成分相對(duì)復(fù)雜，藥效的發(fā)揮并非是單一有效成分的作用，是多成分綜合作用的結(jié)果[11]。多指標(biāo)成分含量測(cè)定是中藥復(fù)方質(zhì)量控制的基本標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到臨床用藥有效、安全的目的。濟(jì)川煎由肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、澤瀉、枳殼及升麻6味藥材組成。從中醫(yī)配伍方面，濟(jì)川煎6個(gè)測(cè)定成分包括君藥肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷、臣藥當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯、佐藥枳殼中柚皮苷和新橙皮苷、使藥升麻中異阿魏酸，測(cè)定成分分別歸屬于濟(jì)川煎“君臣佐使”配伍藥材中，充分體現(xiàn)出中醫(yī)藥的配伍組方特色。從藥效方面，濟(jì)川煎君藥肉蓯蓉含有苯乙醇苷類成分松果菊苷、毛蕊花糖苷，具有改善腸道菌群、提高免疫等作用[12-13]。臣藥當(dāng)歸含有揮發(fā)性成分藁本內(nèi)酯，具有調(diào)節(jié)胃腸功能、調(diào)節(jié)免疫等作用[14-16]。佐藥枳殼含有黃酮類成分柚皮苷、新橙皮苷，能加速胃腸蠕動(dòng)、調(diào)節(jié)胃腸功能等作用[17]。使藥升麻含有酚酸類成分異阿魏酸，具有抗病毒、抗炎等作用[18]，測(cè)定成分藥效作用與濟(jì)川煎治療習(xí)慣性便秘、老年便秘、產(chǎn)后便秘疾病，滋補(bǔ)腎陽、潤腸通便功效基本相符，能反映濟(jì)川煎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。而方中牛膝中β-蛻皮甾酮、澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C成分含量低且水溶性差，水煎煮后導(dǎo)致其含量降低，不易測(cè)出。

綜上，從濟(jì)川煎中醫(yī)配伍和藥效兩方面分析，確認(rèn)既歸屬于“君臣佐使”配伍藥材中，又體現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫、改善腸道菌群、調(diào)節(jié)胃腸道藥效作用的6個(gè)測(cè)定成分，即松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷、異阿魏酸，作為濟(jì)川煎質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

3.2 色譜條件優(yōu)化 由于色譜條件中檢測(cè)波長和流動(dòng)相對(duì)測(cè)定成分色譜峰的數(shù)量、峰形及分離度影響較大，需優(yōu)化檢測(cè)波長和流動(dòng)相。首先考察檢測(cè)波長，2020年版《中國藥典》規(guī)定的肉蓯蓉測(cè)定成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的檢測(cè)波長為330 nm、枳殼測(cè)定成分柚皮苷和新橙皮苷的檢測(cè)波長為283 nm、升麻測(cè)定成分異阿魏酸的檢測(cè)波長為316 nm。文獻(xiàn)中記載肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的檢測(cè)波長為310 nm、當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯檢測(cè)波長為260 nm。故考察不同檢測(cè)波長 260、283、310、316、330 nm 對(duì)測(cè)定成分色譜峰的峰高和數(shù)量影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濟(jì)川煎測(cè)定成分在310 nm檢測(cè)波長下均能被檢測(cè)，因此選擇310 nm為濟(jì)川煎的檢測(cè)波長。其次，考察以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相對(duì)色譜峰的分離度及峰形影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相時(shí)，基線較穩(wěn)定，各色譜峰之間分離度良好，色譜峰峰形最佳，因此選擇乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相。綜上，濟(jì)川煎的檢測(cè)波長為310 nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水。

本研究建立同時(shí)測(cè)定濟(jì)川煎中松果菊苷、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、柚皮苷、新橙皮苷和藁本內(nèi)酯的HPLC法，該方法靈敏度高、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可為濟(jì)川煎的質(zhì)量控制提供依據(jù)。