Leica ST5020全自動組織切片染色機蘇木精-伊紅染色程序設置的體會

汪潔，黃宇翔，蘇麗清，伊雪*，石鶯

（1.廈門醫學院基礎醫學部，福建 廈門 361023；2.廈門醫學院機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室，福建 廈門 361023）

蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining），簡稱HE染色法，是石蠟切片技術的常用染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核酸著紫藍色；伊紅為酸性染料，可使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。將組織切片放入染料后，經一定時間，使組織細胞或其他成分染上不同的顏色，產生不同的折射率，最后于光學顯微鏡下進行觀察和研究。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術方法之一。

隨著科學的不斷發展，微電子技術和計算機技術的不斷進步，程序控制的全自動式組織切片染色機應運而生。染色機可完成模擬手工操作的方法，可連續進行染色、自動記憶，具有可重復性、穩定性，染色效果好、質量控制佳等優點[1]。同時，其可取代手工操作中繁雜且對人體有害的環節，顯著降低勞動力及時間成本，提高工作效率，滿足廣大病理技術工作者的要求，對病理科及現代化實驗室的推進具有重要意義[2]。本校組織病理實驗室于2015年采購了Leica ST5020全自動染色機，經過一段時間對程序設置的研究學習，體會如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2019年5月至2020年5月廈門醫學院附屬第二醫院胸心外科及廈門醫學院呼吸疾病研究所送檢的各類活檢組織標本400例。

1.2 儀器 Leica ASP20S全自動脫水機、Leica EG1150H+EG1150C組織包埋機（含冷臺）、Leica RM2235石蠟切片機、Leica HI1210攤片機、Leica HI1220烤片機、Leica ST5010全自動染色機。

1.3 試劑 改良Lillie-Mayer蘇木精液，1%醇溶伊紅，1%水溶伊紅、1%鹽酸酒精、0.5%鹽酸酒精、4%乙酸、飽和碳酸鋰水溶液、二甲苯及梯度酒精。

1.4 Leica ST5020全自動染色機程序設置 Leica ST5020全自動染色機程序的具體設置，見表1。

表1 Leica ST5020全自動染色機程序設置

2 結果

2.1 蘇木精染色前經乙酸酸化的結果分析 切片進入蘇木精液前先經4%乙酸15 min后，鏡下顯示胞核呈藍色，核內染色質顆粒細膩，核仁、核膜清晰，紅藍對比良好，透明度高，見圖1。

圖1 蘇木精染色前經乙酸酸化的結果分析（×400）

2.2 鹽酸酒精分化液不同濃度及處理方式比較如將分化時間精確為1 s，仍出現分化過度的情況（圖2A），可將鹽酸酒精的濃度從1%降至0.5%。鏡下見染色核質分明，色彩鮮艷（圖2B）。如鹽酸酒精的濃度不變，將分化后的切片重新進入改良Lillie-Mayer蘇木精液中染2 min后水洗返藍，發現細胞質中吸附過多的染料，間質中也出現不應著色的區域，背景偏灰，透明度不高（圖2C）。

圖2 鹽酸酒精分化液不同濃度及處理方式比較（×200）

3 討論

3.1 HE染色前烤片 一般在65℃的溫箱內烤片30～60 min。溫度過高，會引起切片細胞收縮；時間＜20 min，易造成脫片[3-4]。

3.2 二甲苯脫蠟 脫蠟要徹底，時間的設置需根據環境中溫度、濕度、切片溫度、二甲苯使用時間及脫蠟片數決定，時間寧長勿短。脫蠟徹底的切片呈透明狀，若呈云霧狀說明脫蠟不徹底[2]。脫蠟不干凈將影響染色，造成切片染色不均的現象。

3.3 梯度酒精脫二甲苯 切片用二甲苯脫蠟后，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，需經酒精進行溶解，酒精可溶解二甲苯，又能與水混合。組織脫蠟后經由高至低的梯度濃度酒精處理后可進行水洗并與水溶性的染色劑結合。

3.4 染色前組織切片酸化 參照陳世梁等[5]研究，將切片進入蘇木精染液前先經4%乙酸酸化15 min。一方面酸化的組織切片，可增加細胞核的選擇性染色，使細胞核染色質顯示更加清晰細致，從而提高染色質量。另一方面可穩定蘇木精染液的pH值，防止氧化膜形成，延長染液的使用壽命。鏡下見細胞核呈藍色，核內染色質顆粒細膩，核仁、核膜清晰，紅藍對比良好，透明度高。因此，將該步驟設置在常規程序中。

3.5 分化液濃度的選擇及時間的設置 HE染色鹽酸酒精分化至關重要，手工染色分化程序需鏡下控制，一般為1～3 s。由于機械手起落需耗時間，不像手工染色時快速水洗，即使精確設置為1 s，還會出現分化過度的情況。查閱相關資料[6]，按照兩種方法進行設置，一是將鹽酸酒精的濃度從1%降至0.5%，達到較好的分化效果。二是鹽酸酒精的濃度不變，將分化后的切片重新浸入Harris蘇木精液中染色2 min后水洗，再浸入飽和碳酸鋰水溶液返藍，染色對比度、透明度較降低分化液濃度效果差。染色結束后，需將鹽酸酒精分化液倒入棕色瓶內，以免長期放在機器內，腐蝕電子元件[2]。

3.6 返藍液的選擇 返藍液為弱堿性自來水或返藍液。目的是中止鹽酸酒精分化，使在酸性環境下呈紅褐色的切片多為藍色。可用自來水沖洗，也可用0.5%氨水或飽和碳酸鋰水溶液等，均可達到返藍的目的。

3.7 伊紅染液 可選醇溶，也可選擇水溶。如選擇1%醇溶伊紅，設置程序時醇溶性伊紅使用過程中，為減少過多的水分帶入伊紅影響染色效果，可先浸入70%乙醇溶液約1 s，再染伊紅，后入水洗去浮色。而采用水溶性伊紅染色則無需該步驟。切片在70%乙醇中的時間要短，因70%乙醇與1%鹽酸酒精中酒精濃度一致，對切片具有一定分化作用，且低度酒精對伊紅有分色及褪色作用，因此，時間一般設置在數秒內。

3.8 脫水、透明劑的選擇 染色后組織經從低到高的濃度酒精處理，去除組織中殘留的水分，為二甲苯透明組織創造條件，使組織切片的透明度達到光鏡觀察時的要求。最后一缸無水乙醇純度要高，防止將水帶入二甲苯；最后一缸二甲苯純度同樣要高，以便將無水乙醇徹底脫凈。如環境中濕度高、使用時間長、處理的切片多，需及時更換無水乙醇跟二甲苯。

3.9 試劑位置的放置 程序設置時需將水洗的步驟靠近水槽輸出口，可防止機械手提起染色架時染液滴入其他試劑中。分化、返藍試劑也應放置在水槽邊，以縮短機械手在空中停留的時間。

3.10 時間設置 多個程序同時運行時應設置好時間，避免程序沖突。脫蠟、透明所用的二甲苯和脫二甲苯、脫水的無水乙醇可采用部分更新的方法，即第一缸試劑倒入廢液桶，后面的試劑前移，最后一缸倒入新液。

自動染色機的程序設置與多種因素相關，不同品牌的染色機程序設置不同，同一型號的染色機程序設置上也存在差異。為達到更好的染色效果，需實驗技術人員在實際操作過程中進行不斷探索研究。