芥藍SPL基因家族鑒定及表達分析

曾東琳，唐為玲，曾家晶，Gefu WANG-PRUSKI，賴鐘雄，郭容芳，*

(1 福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2 福建農林大學戴爾豪西大學聯合實驗室，福州 350002)

Squamosa-promoter binding protein-like(SPL)蛋白構成了一個轉錄因子的多樣化家族，在植物生長和發育中起著重要作用。該蛋白存在由76個氨基酸組成的高度保守區域即SBP結構域[1]。SBP結構域存在2個鋅指結構，由8個半胱氨酸(Cys)或組氨酸(His)殘基組成，其中前4個氨基酸殘基結合一個鋅離子，后4個氨基酸殘基結合另外一個鋅離子，鋅離子對于維持其構象穩定具有重要作用[2]。此外，SBP結構域還參與核導入和序列特異性DNA結合，該序列特異性DNA可以結合到含有GTAC核心基序和基因特異性側翼區的共有結合位點[3]。研究表明SPL基因在調控植物根系發育[4]、葉片形成[5]、花器官發育[6]、果實成熟[7]、胚胎發育[8]和發育階段轉變[9]等方面發揮著重要作用。

在植物中，轉錄因子能與某些特定基因啟動子區域的順式作用元件特異性結合，激活或抑制基因轉錄，進而調控下游基因的表達[10]。前人發現SPL轉錄因子在植物生長發育、信號轉導及響應生物和非生物脅迫等方面具有重要作用[11-12]。在擬南芥中，由于miR156結合位點的突變而阻礙了其對AtSPL13的負調控而顯著延遲了葉原基的出現，從而AtSPL13在萌發期間延遲了真葉的生長[3]。過量表達SPL3會導致擬南芥葉片起始速率輕微下降[13]。過量表達SPL10會降低擬南芥葉片生長速率，并且過早地經歷營養期變化[14-16]。SPL2可與AS2結合進而調控擬南芥花器官發育[6]。SPL9通過直接激活2個MYB基因來調節擬南芥毛發分布[15]。此外，SPL轉錄因子還參與植物信號傳導，例如光信號傳導[16]、赤霉素信號傳導[17-18]和溫度信號[19-20]等。綜上所述，SPL在調節植物葉片發育、植株生長和信號傳導等方面發揮著重要作用。

芥藍(Brassicaoleraceavar.alboglabra) 是一種十字花科蔬菜，其類型繁多，形態各異。芥藍含有較多的水分、抗壞血酸、礦物質和芥子油苷[21]，在甘藍類蔬菜中有著較高的營養價值，其葉片、花莖到花薹均可食用[22]。其中‘改良香菇’芥藍生長勢強，葉面有花狀變形葉，產量高，商品性狀好，風味口感酥脆[23]。因此‘改良香菇’芥藍的葉片是其重要的植物學性狀，可以作為雜交種試配的依據，也可以作為指示性狀。本研究以‘改良香菇’芥藍為試驗材料，對芥藍SPL基因(BoSPL)進行全基因組鑒定及分析，并對芥藍不同生長時期及不同組織部位進行定量分析，克隆BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2基因，為進一步揭示‘改良香菇’芥藍葉片發育過程的分子機制，利用基因編輯技術調控芥藍葉片發育，豐富芥藍種質資源，培育芥藍新品種奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

‘改良香菇’芥藍由廣東揭陽農友種子有限公司提供，種植于福建農林大學溫室大棚前地塊。挑選長勢良好的‘改良香菇’植株，將其分為抽薹未開花時期(Ⅰ)和全部結莢期(Ⅱ)2個時期，在Ⅰ時期對植株的根、真葉、薹葉和花莖進行取樣；在Ⅱ時期對植株的根、真葉、薹葉、花莖、處于子葉形胚時期的種子和種莢進行取樣。為了進一步鑒定調控芥藍花狀變形葉發育過程中的基因，種植‘改良香菇’芥藍于福建農林大學園藝樓培養室內。培養至30 d時，挑選長勢良好的‘改良香菇’植株，取其葉片的4個部位：葉緣、葉肉、葉脈和花狀變形葉，每份樣品0.1 g，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取以及cDNA合成選用TaKaRa試劑盒RNAiso Plus(Code No.9109)提取芥藍樣品RNA；使用超微量分光光度計測定RNA濃度及吸光值(OD值)，測定結果OD500值在1.8～2.0 之間為最佳。使用PrimeScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser (Code No. RR047A)試劑盒進行反轉錄成cDNA。

1.2.2 芥藍SPL基因家族全基因組鑒定通過網站(https://plants.ensembl.org/)下載甘藍基因組序列，從擬南芥基因組數據庫(http://arabidopsis.org/)獲得SPL基因家族ID號，利用擬南芥基因組中已公布的SPL氨基酸序列作為種子序列，與芥藍參考基因組數據庫進行同源比對獲得同源基因。再將同源基因與NCBI數據庫中的SWISS-MODEL進行蛋白質序列比對，采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析蛋白結構域，進一步分析以確定該家族中的成員個數。運用在線網站對BoSPL進行蛋白理化性質(https//web.Expasy.org/protparam/)、信號肽(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)和亞細胞定位(http//cello.life.nctu.edu.tw/)分析。運用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpb/bwrpsb.cgi)在線網站分析BoSPL基因結構。使用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析該家族成員編碼蛋白的保守基序。使用TBtools繪制基因結構和保守基序圖。將預測出來的BoSPL家族的蛋白質序列，結合由TAIR官網(https://www.arabidopsis.org/)上下載的擬南芥SPL蛋白質序列，運用MAGA-X進行多重序列比對，使用最大似然法(maximum likelihood)構建系統進化樹，自展法系數(Bootstrap)設置1 000次重復來檢驗分支點的穩定性。

1.2.3 基因克隆根據‘改良香菇’不同時期組織部位表達模式結合文獻中與葉片發育相關的SPL基因，選擇BoSPL3-1[13]、BoSPL10-2[13-14, 24]和BoSPL11-2[24]進行基因克隆，GeneBnak上獲得的登錄號分別為OK050589、OK050588和OK050590。并設計PCR擴增引物(表1)。以‘改良香菇’葉片cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系如下：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物使用Thermo science Gene JET Plasmid Extraction Kit(Code No.00967821)試劑盒進行膠產物回收，回收產物-20 ℃冰箱保存。

1.2.4BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2亞細胞定位使用Snapgene3.2.1設計引物(表1)，去除終止密碼子并分別在5′端加上NcoⅠ 和SpeⅠ酶切位點，將上述目的片段與pCAMBIA1302載體連接后轉DH5α大腸桿菌感受態細胞，平板培養后挑單克隆菌落，以pCAMBIA1302-35S-GFP質粒上功能元件35S、GFP設計上下游引物pCAMBIA1302(表1)進行PCR篩選鑒定，鑒定成功的重組質粒通過凍融法轉至農桿菌GV3101。最后通過農桿菌侵染法對煙草下表皮細胞進行瞬時表達，以空載pCAMBIA1302-35S-GFP為對照，培養48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2的定位情況。

表1 引物序列

1.2.5BoSPL基因熒光定量表達使用TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ (Code No. RR820A)進行qRT-PCR反應，以BoActin為內參基因，使用CFX96 Real-Time PCR Detection System進行定量檢測；利用Microsoft 2007軟件整理試驗數據，結果為3次生物學重復的平均值±SD，采用SPSS 24軟件中的Duncan法進行顯著性分析(P<0.05)。利用Primer Preminer5軟件進行qRT-PCR引物設計(表1)。

2 結果與分析

2.1 BoSPL基因家族全基因組鑒定

利用生物信息學方法共獲得芥藍31個BoSPL家族成員，根據擬南芥已有的命名方式，依次命名為BoSPL1-1～BoSPL16-2(表2)。蛋白質特性分析發現，該家族成員編碼蛋白質的氨基酸長度從157～1 028 aa不等；分子量介于18 041.04～113 747.21 Da之間，其中BoSPL1-1、BoSPL7-2、BoSPL10-1等電點小于6.55，屬于酸性蛋白；其余BoSPL家族成員等電點均大于6.66，屬于堿性蛋白；BoSPL蛋白質的氨基酸均沒有信號肽，屬于非分泌蛋白；亞細胞定位預測結果顯示，所有的BoSPL家族成員均有定位在細胞核上，少數成員有定位在液泡、葉綠體和細胞質中。

表2 芥藍SPL基因家族成員信息

使用MEME對BoSPL家族蛋白序列進行保守基序分析(圖1)，設定搜索出10個motif，分別命名為motif 1—10，motif 1、2、3高度保守，31個BoSPL成員中均含有該基序，推測其為SBP保守結構域。結合進化關系與保守基序圖可以看出進化關系相似的BoSPL家族成員其保守基序分布相似。其中有4個成員包含motif 9，6個成員包含有motif 4、7、10，7個成員包含motif 8，13個成員中包含motif 6，20個成員包motif 5。

基因結構分析發現(圖1)，鑒定到的31個BoSPL均有內含子，其數量1～9個不等；外顯子數量2～10個不等。其中，BoSPL3-1、BoSPL3-2、BoSPL5-1、BoSPL5-2、BoSPL5-3、BoSPL5-4、BoSPL5-5和BoSPL6-1均包含2個外顯子，占總數的25.8%；BoSPL6-2、BoSPL8-1、BoSPL8-2、BoSPL9-1、BoSPL9-2、BoSPL13A-1、BoSPL13A-2、BoSPL13A-3、BoSPL15-1和BoSPL15-2均包含3個外顯子，占總數32.3%；BoSPL2-2、BoSPL10-1、BoSPL10-2、BoSPL10-3、BoSPL11-1和BoSPL11-2均包含4個外顯子，占總數的19.4%；BoSPL2-1擁有5個外顯子占總數的3%；BoSPL1-1、BoSPL7-1、BoSPL7-2、BoSPL14-1、BoSPL16-1和BoSPL16-2均包含10個外顯子占總數19.4%。結合基因結構和系統進化關系得出結構相似基因的內含子數量大多一致，親緣關系也越近。

圖1 芥藍SPL基因家族成員蛋白保守基序和基因結構分布圖

使用芥藍和擬南芥SPL蛋白序列構建一個極大似然系統發生樹(圖2)。擬南芥中有16個SPL轉錄因子，根據其SBP保守結構域的氨基酸序列可分為8個進化支：AtSPL1/12/14/16、AtSPL2/10/11、AtSPL3/4/5、AtSPL6、AtSPL7、AtSPL8、AtSPL9/15和AtSPL13[25]。根據擬南芥中SPL分類結合進化關系，將芥藍SPL分為Ⅰ～Ⅷ共8個亞族，各族成員分別包含4、2、3、2、7、4、2和7個成員。從系統進化樹中可以看出BoSPL的進化關系與AtSPL相似。

○.芥藍；▲.擬南芥

2.2 BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2基因克隆及重組質粒構建

PCR擴增凝膠電泳結果顯示，圖3，A-C分別在500 bp、1 200 bp和1 200 bp左右有一條清晰的條帶，其大小均與預期一致，表明BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2基因克隆成功；圖3，C-E分別在700 bp、1 400 bp和1 400 bp左右有一條清晰的條帶，表明pCAMBIA1302-35S-BoSPL3-1-GFP、pCAMBIA1302-35S-BoSPL10-2-GFP和pCAMBIA1302-35S-BoSPL11-2-GFP重組質粒構建成功，可用于亞細胞定位。

M. DL2000；A-C.BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2基因的克隆； D-F.pCAMBIA1302-35S-BoSPL3-1-GFP、pCAMBIA1302-35S-BoSPL10-2-GFP和pCAMBIA1302-35S-BoSPL11-2-GFP重組質粒

2.3 BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2亞細胞定位分析

經鑒定正確的重組質粒pCAMBIA1302-35S-BoSPL3-1-GFP、pCAMBIA1302-35S-BoSPL10-2-GFP和pCAMBIA1302-35S-BoSPL11-2-GFP轉化到根癌農桿菌GV3101，將轉化成功的含有亞細胞定位載體的農桿菌用于瞬時轉化煙草下表皮細胞，在激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光信號。實驗結果如圖4所示，BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2亞細胞定位均在細胞核中，該結果與預測結果一致。

圖4 BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2蛋白在煙草葉片的亞細胞定位

2.4 BoSPL家族基因在不同生長時期不同組織部位的qRT-PCR分析

根據系統進化關系結合陳文文等[26]不同亞族SPL基因功能不同，綜合選取BoSPL1-1、BoSPL3-1、BoSPL10-2、BoSPL11-2、BoSPL14-1和BoSPL16-1設計引物做qRT-PCR分析，探討其在‘改良香菇’芥藍中不同生長時期不同組織部位表達模式(圖5)。

結果顯示，BoSPL3-1在種子中表達量較低，BoSPL1-1、BoSPL10-2、BoSPL14-1和BoSPL16-1在種子中的表達量較其他部位相比均較高，推測BoSPL1-1、BoSPL10-2、BoSPL14-1和BoSPL16-1可能與胚胎發育相關；其中在Ⅰ時期中葉片的表達量普遍比Ⅱ時期高；推測BoSPL可能與葉片發育早期的關系更為密切。BoSPL10-2在Ⅰ時期中的真葉和薹葉中相對表達量較高，推測其可能與葉片發育具有相關性，這與前人研究一致[11]；BoSPL11-2在Ⅰ時期中根與真葉的表達量最高，推測其可能與植物的根、真葉發育相關性較大。

2.5 BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2在葉片不同部位的qRT-PCR分析

根據‘改良香菇’芥藍不同時期不同組織部位的表達模式(圖5)，結合Shikata等[24]過表達的SPL10/11具有寬的莖生葉，并且莖生葉和莖上有許多毛狀體，且SPL10轉基因植物的形狀還會受到影響。綜合分析選取BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2設計引物做qRT-PCR分析其在‘改良香菇’葉片不同部位的表達模式(圖6)。

R. 根；E. 真葉；SL. 薹葉；FM. 花莖；PD和SD為子葉胚時期的種莢、種子；Ⅰ. 抽薹未開花時期；Ⅱ. 完全結莢期；小寫字母表示同一基因間0.05水平顯著性差異，下同

A. ‘改良香菇’芥藍葉片模式圖；B. BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2在‘改良香菇’芥藍葉片表達模式：ME. 葉肉；LM. 葉緣；LV. 主葉脈；FL.花狀變形葉

結果顯示，BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2在葉肉中相對表達量無顯著差異。3個BoSPL基因中BoSPL10-2在花狀變形葉中的表達量最高，表明BoSPL10-2可能與花狀變形葉形成相關機制有關聯，其作用機制如何有待進一步研究。

3 討 論

SPL基因存在于所有綠色植物中，包括苔蘚、裸子植物和被子植物[27-28]。本研究共鑒定到31個BoSPL成員，成員數量多于擬南芥(16個)[11]、水稻(19個)[29]和番茄(15個)[30]。鑒定得到BoSPL家族成員內含子數量在1～9個之間，進化關系相似，其基因結構相似性高。所有家族成員中均包含motif 1、motif 2、motif 3推測其構成SBP保守結構域，結構域的存在可能涉及到其進化關系以及行使基因功能的重要性。SBP結構域參與核導入和序列特異性的脫氧核糖核酸結合，該脫氧核糖核酸結合到含有GTAC核心基序和基因特異性側翼區的共有結合位點[3]。依據進化關系結合擬南芥中的分類可以將BoSPL劃分為8個亞族[25]，且系統進化樹表明BoSPL進化關系與擬南芥相似。值得注意的是，本研究中未鑒定到BoSPL4和BoSPL12，這可能是由于甘藍中不存在這兩個基因，其結果有待進一步驗證。

亞細胞定位預測發現BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2定位于細胞核中，與預測結果相一致(表2)，表明其可能在細胞核內發揮調控作用。為進一步確定與葉片發育相關的BoSPL基因，本研究對6個BoSPL家族成員，檢測不同時期不同組織部位的表達模式，結果表明各成員在檢測組織中均有表達，但表達量存在明顯差異，BoSPL1-1、BoSPL10-2、BoSPL16-1在種子中表達量較高，這與先前文章報道SPL與胚胎發育相關具有一致性[8]。此外，BoSPL3-1在Ⅰ時期的花莖和薹葉中的相對表達量較高，表明其可能與成花誘導具有相關性[31-32]；BoSPL10-2在Ⅰ時期中薹葉與真葉中的相對表達量較高，推測其與葉片發育相關[11]；BoSPL11-2和BoSPL14-1在Ⅰ時期根中的相對表達量較高，說明BoSPL不同成員發揮作用的主要部位不同[4, 33]。在對‘改良香菇’葉片不同部位檢測BoSPL3-1、BoSPL10-2和BoSPL11-2的相對表達量，各基因在葉肉中的相對表達量無明顯差異，值得注意的是BoSPL10-2在花狀變形葉中顯著表達，推測其可能與花狀變形葉形成相關，其具體機制如何有待進一步驗證。