晉陽湖絲狀藍藻的形態學分析與分子鑒定

肖 喆，王 捷*，石 瑛, 2，王清華，李艷暉，譚梅娟

(1 太原師范學院 生物系，山西晉中 030619，2 山西工程科技職業大學，山西晉中 030619)

晉陽湖位于山西省太原市晉源區，是華北地區最大的人工湖，享有“中國北湖”的美稱。晉陽湖水體由汾河西干渠引入，與平原水體的性質相似，最初用途是為太原市第一熱電廠提供冷卻用水，現主要以其為主體構建城市公園[1]。藍藻生存環境廣泛，種類繁多，具有較高的研究價值和利用潛力。有研究表明，顫藻目(Oscillatoriales)和念珠藻目(Nostocales)等分類單元下的絲狀藍藻可固定大氣中的氮轉化為含氮化合物[2-3]。在研究結皮微藻多樣性時，發現細鞘絲藻亞科和顫藻科(Oscillatoriaceae)等中的絲狀藍藻可與沙土黏附以便形成生物結皮[4-6]，改善土壤環境。顫藻目和聚球藻目(Synechococcales)等中的藍藻在生產生物燃料等工業方面也具有良好的前景[7]。但某些種類在富營養化水體中產生水華，并成為藻源毒素主要的制造者。晉陽湖水體中生活著大量的藻類，目前對于晉陽湖的藍藻甚至是其他藻類研究較少。因此，對于晉陽湖絲狀藍藻的研究可為今后該湖藻類資源利用提供一定的理論基礎。

藍藻為富氧光合自養藻類，形態簡單、獨特且多樣，在多種環境中存活[8]，甚至可生活在溫度極高或極低的惡劣環境中[9]。中國對于藍藻分類學研究起步較晚，在解放后才正式開始[10]，胡鴻鈞和魏印心等科學家為了中國藻類學的科研工作、教學及生產所需，將中國淡水藻類大多數屬重新整理，并編寫成《中國淡水藻類——系統、分類及生態》一書，該書已成為國內藻類分類學研究的重要依據之一[11]。藻類分類學的主要工作包含命名、形態特征描述、分群歸類，并利用系統發育分析其親緣關系。近年來，藍藻分類不再只依靠形態學，而是基于多相分類方法(生態學、形態學、生物化學和分子數據等相結合)定義新類群和經典藻類的分子表征[12-13]。顫藻目和聚球藻目中包含許多鑒定不明確的物種，分子分析證明它們是多系的，給分類工作增加了極大的阻力。

早期的分類系統中，顫藻目包括不含具異形胞的絲狀藍藻。2014年，Komrek等根據類囊體的超微結構及系統發育分析將顫藻目分為兩個目：顫藻目與聚球藻目[14]。目前，聚球藻目下有12個科：Heteroleibleiniaceae，細鞘絲藻亞科(Leptolyngbyaceae)，Oculatellaceae，偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)，Romeriaceae，裂須藻科(Schizotri-chaceae)，Acaryochloridaceae, 管胞藻科(Chamaesiphonaceae), Coelosphaeriaceae, 平裂藻科(Merismopediaceae), Prochloraceae和聚球藻科(Synechococcaceae)。其中前6科包含絲狀藍藻形態的藻種[15]。顫藻目的成員其形態差異較小，但遺傳多樣性和變異性強，且均不含異形胞[16-17]。當環境中的水溫和營養物(尤其是磷)濃度高，水的流動性不強時，顫藻的生長趨于旺盛。因此，水庫、湖泊和水壩等地的顫藻會頻繁出現[18]。顫藻在生長過程中可固定CO2，并生成生物燃料等物質，但有些顫藻可產生藻毒素，過度繁殖可污染水資源，對水生動物和人體健康造成損害[19]。對晉陽湖水體中絲狀藍藻種類及數量調查是亟待研究解決的問題。

本研究對晉陽湖及周邊地區的藻類進行采集與分類，觀察并記錄了藻類的生存環境及生態分布。分離純化其中的絲狀藍藻，觀察藻絲長度、細胞長寬、頂端細胞形態等，同時運用16S rRNA基因序列與NCBI數據庫中同源性較高的序列構建系統發育樹，確定絲狀藍藻的遺傳屬性，以期對晉陽湖藍藻種類有進一步的了解，豐富該地區藍藻的多樣性，研究結果對預防湖泊藍藻水華的發生起到預警效果，對維護水資源環境穩定與生態平衡提供科學數據，并為后續晉陽湖藍藻資源利用與開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 藻種采集和分離

樣品采集地為山西省太原市晉陽湖，采樣時間為2019和2020年3月、6月、9月和11月4個月份，每月2次采集水體中的藻類植物，使用25號浮游生物網和鑷子、刷子等工具分別采集浮游和石頭等附著的藻類，采集地的詳細經緯度信息見表1，采集點位置在圖1標出。將采集到的新鮮藻樣帶回實驗室鏡檢，并利用經典的毛細管分離法[15]分離純化藻類，首先在倒置顯微鏡下挑取單個藻絲體，使用無菌水多次清洗，然后放入含有BG-11培養基[20]的24孔細胞培養板中培養，確定為單克隆培養后可轉入到三角瓶中擴大培養。培養溫度為(25±1)℃，光周期為12 h∶12 h。純化后的藻種保存在太原師范學院淡水藻種庫中，其編號分別為JYH005、JYH008、JYH010、JYH012和JYH022。

圖1 紅色點顯示晉陽湖的采樣地點

表1 山西省晉陽湖采樣信息

1.2 顯微觀察和測量

將藍藻藻絲體制作成顯微玻片標本，在Nikon ECLIPSE NI型光學顯微鏡下觀察，使用外接電腦的NIS-Elements D5.20軟件拍攝藻種的形態特征，并測量與分析藻絲、細胞長寬等數據。每個樣本至少測定30個細胞的大小、藻體形態、鞘的形態、末端細胞的形狀等數據，并對其形態進行觀察和描述。

1.3 基因組DNA提取和PCR擴增

DNA提取的操作步驟：取適量藻液離心，去除上清培養基，大約濃縮1.5 mL新鮮的藻液來提取DNA。加入無菌蒸餾水，使用凍融法破除細胞。為使細胞裂解充分，加入PlantZol裂解液并金屬浴。然后利用DNA提取酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)多次抽提上清液，使蛋白質及多糖等雜質變性沉淀，離心后去除沉淀。最后利用DNA不溶于乙醇的特點沉淀出DNA。室溫揮發乙醇，加入無菌蒸餾水懸浮DNA，保存在冰箱中。

PCR擴增：擴增16S rRNA序列所用引物為F1和1 492[21-22]。PCR反應體系為20 μL，包含2.5 mmol·L-1dNTP 混合液2 μL，5 U·μL-1taq DNA 聚合酶 0.2 μL，10 μmol·L-1正反引物各2 μL，10× Easy Taq Buffer 2 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O為10.8 μL。PCR的條件如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，此階段循環35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物點樣于1%瓊脂糖凝膠并電泳，檢驗產物，以確保獲得預期擴增的序列。將純化的PCR產物測序，測序工作交由北京華大基因公司完成。

1.4 系統發育樹分析

測序獲得的序列為ABI和SEQ兩種文件類型，可用BioEdit 7.0軟件處理，并上傳在NCBI數據庫中BLAST進行對比，下載不同相似度的同源序列，基于16S rRNA基因的序列在BioEdit7.0軟件中進行多重序列比對，然后手工編輯序列。系統發育樹是在MEGA7.0軟件中構建，鄰接法(neighbor-joining method, NJ)和最大似然法(maximum likelihood, ML)使用的模型為Kimura 2-parameter model[23]。所有的系統發育評估均計算1 000次重復。同樣利用MEGA7.0軟件通過最大似然分析(ML)驗證了樹狀拓撲結構的可靠性。

2 結果與分析

2.1 形態學分析

根據光學顯微鏡下觀察到的形態特征，鑒定出4株絲狀藍藻屬于聚球藻目，其中2株屬于細鞘絲藻亞科，2株屬于偽魚腥藻科，1株絲狀藍藻屬于顫藻目分類單元下的沙絲藻科。表2和圖2詳細描述了分離到的5株絲狀藍藻的形態特征。

A、B.JYH005，具明顯的鞘；C、D.JYH008, 含死細胞，偶爾具鞘；E、F.JYH010，具鞘，末端圓柱狀或漸細；G、H.JYH012, 藻絲體偶爾纏繞； I、J.JYH022，具鞘

表2 本研究中絲狀藍藻的形態學描述

2.2 分子系統分析

分離純化得到的5株絲狀藍藻的系統發育關系如圖3所示，以GenBank數據庫中下載的紫色粘菌藻(Gloeobacterviolaceus)序列為外類群構建系統發育樹。使用NJ、ML和MP方法構建的系統發育樹拓撲結構基本一致，本研究以MP系統發育樹為基準，標注了3種方法構建系統樹所計算出的支持率。系統發育樹中顯示了所研究的5株絲狀藍藻聚為3個不同的大支系，JYH005與JYH012為細鞘絲藻亞科，JYH008與JYH022為偽魚腥藻科，JYH010為沙絲藻科。

節點處數字代表NJ，ML和MP構建系統發育樹的支持率，低于50%的未顯示

對JYH005、JYH008、JYH010、JYH012和JYH022五株絲狀藍藻進行16S rRNA基因序列分析，將擴增出的序列片段與BLAST數據庫中的序列對比表明，藻種JYH005與GenBank數據庫中的結節結絲藻(NodosilineanodulosaMH179051)相似度為98.9%；藻種JYH012與細鞘絲藻屬Lep-tolyngbyamargaretheana(FR798934)的相似度為99.1%；這表明藻種JYH012和藻種JYH005與細鞘絲藻科的親緣關系較近。藻種JYH008與Arthronemaafricanum(KM019913)的相似度為97%；藻種JYH022與偽魚腥藻科藍藻(KF246480)的相似度為97.2%，與其他藍藻的相似度低于90%，無法確定其屬的位置；所以藻種JYH008和藻種JYH022的親緣關系與偽魚腥藻科相近。藻種JYH010與塔爾沙絲藻(DesertifilumtharenseMW411006)的相似度為99.6%；與沙絲藻屬的藻種聚為一支，說明兩者的親緣關系較近。

3 討 論

藍藻又被稱為藍細菌，因此藍藻的分類受控于植物學和細菌學兩個學科。傳統分類主要依據藻類的形態特征，但某些藍藻會表現出可塑性，藻種之間的進化關系難以準確構建[28]。現代的藍藻分類修訂和重新構建分類基于多相方法，藍藻分類的首要標準即為確定其分類單元的系統發育位置[29]。分子生物學技術的發展對某些在形態方面難以分辨的藍藻(如顫藻目)分類起到了巨大的作用。

基因16S rRNA高度保守，具有“生物進化分子鐘”的稱號。原核生物屬及屬以下水平的分類均可采用該基因序列，許多學者對這一基因序列的可靠性進行了檢測，結果得到了肯定[30]。通常情況下，根據分離株的形態特征都可將其鑒定到屬水平，某些物種具有非常特別的形態特征的話，也可鑒定到種水平[31]。藍藻分子生物學研究對彌補傳統形態學分類體系的缺陷起到了關鍵的作用，提供了更完善的基礎基因數據，藍藻的分類學研究日益趨于完善，更親近于物種自然親緣關系的圖譜建立[32]。

本研究采用基于傳統形態學和分子16S rRNA序列結合的方法，對5株晉陽湖絲狀藍藻進行了表征。在這5株絲狀藍藻中，JYH012屬于細鞘絲藻屬，該屬由于缺乏典型的判斷特征或與相關類群有重疊特征，僅依靠形態特征無法準確鑒定。事實上細鞘絲藻屬的形態特征極其簡單，主要表現在藻體薄，藍綠色，無異形胞，藻絲體寬度小于3.5 μm，具鞘且每鞘只包裹著1個藻絲體，類囊體分布在細胞周圍[33-34]。而JYH012藻株藻絲體極細，藻絲單生或纏繞，橫壁收縊明顯，細胞內偶爾可見顆粒狀，這與該屬的形態特征不同。JYH005屬于結絲藻屬，該屬的模式種為結節結絲藻(Nodosilineanodulosa)[24]，JYH005與該屬的典型特征基本吻合，但是在培養過程中未觀察到膨脹的鞘。JYH022為偽魚腥藻科，由于該藻株序列信息與該科其他屬的相似度低于90%，因此只能確定到科水平，物種之間的相似度低于94.6%即為不同屬[35]。JYH008與Komrek等修訂的屬Arthronema[25]形態特征基本一致，但是已報道的Arthronema形態未見死細胞，而對JYH008形態觀察時發現藻絲中有死細胞，可通過死細胞進行繁殖。JYH010形態基本符合沙絲藻屬[26]所描述的形態特征，但是未在JYH010藻絲中觀察到氣囊，原因可能是實驗室培養條件優越，造成了表型的改變。

本研究以從山西省太原市晉陽湖分離純化出的5株絲狀藍藻為實驗樣品，利用光學顯微鏡觀察其形態結構特征，并采用16S rRNA序列分析其系統發育關系，確定其分類單元，對山西淡水湖泊絲狀藍藻種類有了進一步的了解，為可能發生的水華的防控提供理論基礎，也為深度利用晉陽湖絲狀藍藻生物資源提供有效信息。