基于變分水平集主動輪廓的葉片表皮細胞厚度測量方法研究

孫小添 王海超 郭根勝 裴志永

摘 要：針對傳統葉片橫切面寬度測量效率低、重現性差、勞動強度大，以及已有圖像處理算法精度不高等問題，本研究提出一種基于變分水平集主動輪廓算法來提高葉片圖像分割效果，從而更準確地測量細胞厚度。以狹葉錦雞兒（Caragana Stenophylla Pojark）葉切片表皮細胞為研究對象，依據圖像特點，首先采用基于幾何均值和三維塊匹配算法，實現圖像盲去噪;然后采用變分水平集主動輪廓算法，分割預處理后圖像提取表皮細胞;最后采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細胞輪廓2交點，通過計算2交點間的距離，并除以對應比例關系，得出表皮細胞實際厚度。結果表明，①圖像經去噪后，有效去除圖像噪聲，圖像質量明顯提高，相較傳統Lazy Snapping算法和Graph Cut算法，本文提出算法雖耗時較長，但分割效果很明顯，平均分割誤差（R）、過分割誤差（OR）和欠分割誤差（UR）分別為5.670%、0.589%和5.900%，所用時間為30.228 s;② 通過與交互測量值的比較得出，本文算法測量值與交互測量值間相對誤差為3.27%，均方根誤差為0.983，相對較小，結果較準確;③通過對同一幅圖像30次重復測量后發現，相較ToupTek（高分辨率智能顯微鏡成像CCD相機）Toupview軟件交互測量方法，本文算法用時更短，穩定性較高，誤差為0.007。

關鍵詞：厚度測量;變分水平集;主動輪廓;表皮細胞;狹葉錦雞兒

中圖分類號：TP391.41;S77??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）02-0001-07

Extraction and Thickness Measurement of Leaf Epidermal Cells Based

on Active Contour of Variational Level Set Method

SUN Xiaotian， WANG Haichao， GUO Gensheng， PEI Zhiyong*

（College of Energy and Transportation Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China）

Abstract：Aiming at the problems of low efficiency， high labor intensity， poor reproducibility and low accuracy of the existing image processing algorithms， in this study， an active contour algorithm based on variational level set was proposed to improve the segmentation effect of leaf image， so as to measure cell thickness more accurately. The epidermal cells of Caragana Stenophylla Pojark leaf slice were taken as the research object. Based on the image characteristics， the geometric mean and 3D block matching algorithm were firstly adopted to realize image blind denoising. Then the active contour algorithm based on variational level set was used to segment the pre-processed epidermal cell images and realize the extraction of epidermal cells. Finally， the fast marching skeleton extraction algorithm was used to determine the intersection of the vertical line of the local fitting center line on the skeleton curve and the epidermal cell contour. The actual thickness of epidermal cells was obtained by calculating the distance between the two intersections and dividing it by the corresponding proportional relationship. The results showed that： ① After denoising， the image noise was effectively removed and the image quality was significantly improved. Compared with traditional Lazy Snapping algorithm and Graph Cut algorithm， the algorithm proposed in this paper took a long time， but the segmentation effect was obvious. Mean segmentation error （R）， over-segmentation error （OR） and under-segmentation error （UR） value were 5.670%， 0.589% and 5.900%， respectively， the average time was of 30.228 s. ② Through the comparison with the interactive measured values， the relative error between the measured values and the interactive measured values of the algorithm in this paper was 3.27%， and the root mean square error was 0.983， which was relatively small and the results were relatively accurate. ③ After repeated measurement of the same image for 30 times， it was found that， compared with the interactive measurement method of ToupTek Toupview software， the algorithm in this paper had shorter time， higher stability with an error of 0.007.

Keywords：Thickness; variational level set method; active contour; epidermal cells; Caragana Stenophylla

0 引言

狹葉錦雞兒（Caragana stenophylla Pojark）是我國北方荒漠草原優勢物種，屬強旱生小灌木，具有良好的防風固沙性能。經過對其研究發現，干旱程度與表皮細胞直徑呈正相關，葉片通過增大表皮細胞直徑抑制水分蒸騰，在一定程度上提高水分利用率。表皮細胞尺寸的準確測量，對植物生理生態學研究十分重要。表皮細胞厚度為表皮細胞直徑與角質層厚度之和，該指標的準確測定對揭示植被對環境變化的響應機制具有重要意義，由于葉切片顯微圖像具有結構復雜、邊界模糊、存在噪聲和色差等特點，制約了傳統尺寸測量算法在葉切片表皮細胞厚度測量中的應用。

傳統指標尺寸測量常采用交互測量方式，該方式存在較大的人為主觀因素干擾，不但效率低，勞動強度大，而且誤差和重現性較差。目前，由于圖像處理技術蓬勃發展，圖像處理技術被廣泛應用于特征指標尺寸測量。紀平等選擇Canny算子對番茄邊緣進行提取，通過對番茄面積、圓心和半徑等參數的統計分析，進行圓擬合，實現了各幾何尺寸測量;包能勝等提出一種新的算法實現了輥式涂布涂層厚度測量，其基于啟發式蟻群算法與傳統機理建模法相比，最大誤差為5.74%，平均誤差為4.04%;路文超等通過擬合麥穗主部中心線方式和統計曲線穿過麥穗區域方式計算麥穗長度和麥穗數量，測量結果絕對誤差為0.47 cm，相對誤差為3.95%。曾德斌等通過對羊只圖像預處理、分割和輪廓提取等算法，實現了羊只個體體長和提高了測量精度，測量平均相對誤差小于1%，相關系數達到了0.999 7。Sunoj等針對向日葵花大小人工測量尺寸存在主觀和費時的缺點，開發了一種ImageJ用戶編碼插件，該插件采用字段圖像采集方式，用于測量單個向日葵尺寸，與直接法相比，采用包裹多邊形法十分有效，等效直徑和擬合橢圓短軸有較高相關性，相關系數為0.88;Jin等提出一種基于雙投影的孔尺寸測量方法，使用CCD相機分別采集在零件表面上2個方向投影的光柵圖像，采用相移位法計算2個方向上的光柵圖像的相位，將構建的2個方向上的三維圖像合并起來測量孔的尺寸，其厚度測量精度0.04 mm，孔尺寸精度0.1 mm，該方法解決了機械零件表面孔測量不精確問題;Singh等結合圖像處理和機器學習算法，提出一種利用遞歸方法從稻米粒圖像中識別各米粒大小，并根據每粒稻米粒所占像素來估計籽粒大小，進而預測稻米質量，測量小粒稻谷、中粒稻谷、大粒稻谷長度的平均誤差分別為3.6%、2.5%和2.4%。

植物葉片圖像的合理分割，對植物結構的準確分析十分重要。狹葉錦雞兒葉片解剖結構表皮細胞與柵欄組織交界十分模糊，且表皮細胞形態不規則，采用傳統分割算法很難達到分割效果。變分水平集主動輪廓圖像分割算法是近年來圖像分割領域研究的熱點，針對傳統葉片橫切面寬度測量效率低、重現性差、勞動強度大，以及已有圖像處理算法精度不高等問題，本研究提出一種基于變分水平集主動輪廓算法來提高葉片圖像分割效果。首先采用基于幾何均值和三維塊匹配算法，實現圖像盲去噪;通過變分水平集的主動輪廓算法，分割去噪后的圖像;最后通過采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細胞輪廓2交點，通過計算2交點間的距離，并除以對應比例關系，實現表皮細胞厚度測量。

1 材料與方法

1.1 圖像獲取

采用石蠟切片法獲取狹葉錦雞兒葉片表皮細胞圖像，詳見文獻。本文使用YYS-80E型光學生物顯微鏡和配套CM1400攝像機進行拍照及存儲，根據視野范圍需求，選擇×40目鏡，圖像分辨率為1 792×1 374，由于人工制片不僅受相機曝光增益的影響，還受溫度和染液濃度等因素的影響，圖像不可避免存在噪聲和色差，如圖1所示。

1.2 圖像分割

1.2.1 圖像去噪

表皮細胞圖像具有較多的紋理和邊緣信息，較大的噪聲不但影響圖像品質，而且會影響后續圖像分割精度，進而影響厚度測量的準確性。本文針對狹葉錦雞兒葉片表皮細胞圖像特點，采用基于幾何均值和三維塊匹配算法，實現圖像盲去噪，具體詳見文獻。

1.2.2 圖像分割

狹葉錦雞兒葉片表皮細胞內側表現為柵欄組織，采用傳統圖像分割算法很難準確分割柵欄組織這種邊緣不明顯、表皮細胞形狀不規則的葉片。因此，針對傳統交互式圖像分割算法不精確問題，提出將變分水平集算法與主動輪廓算法相融合，即變分水平集主動輪廓算法。將C-V（Chan-Vese）模型、測地線主動輪廓模型和邊緣檢測算子相融合，使用變分原理對能量泛函進行極小化偏微分求解，并依托水平集方式實現函數表達。該算法能夠克服主動輪廓曲線演進收斂過程中取參過量的問題，同時還能彌補其演進過程中無法自由拓撲的不足，一定程度上解決了算法運行速度慢和普適性的問題。其基本原理如下。

設有一幅圖像為I，在目標區域任意畫一條閉合曲線C，C內部定義為ΩC，即目標區，外部定義為Ω＼ΩC，即分離區。當C離目標圖像的邊緣原來越遠時，C的灰度階級梯度將逐漸減小，反之增大。c1和c2分別為ΩC和Ω＼ΩC的灰度均值，當能量函數E（C，c1，c2）值最小時，其圖像分割更為準確，其表達式為

E（C，c1，c2）=αEGAC（C）-βEAR（C）+γEMV（C，c1，c2）=α∮Cg（C（s））ds-β∮C〈SymbolQC@I，N→〉ds+γλ1ΩC（I-c1）2dxdy+λ2Ω＼ΩC（I-c2）2dxdy 。（1）

〈N→，SymbolQC@I（C）〉=SymbolQC@I（C）cosθ。

式中：EGAC（C）為變分測地線主動輪廓能量函數;EAR（C）為梯度能量函數;EMV（C，c1，c2）為C-V模型能量函數;g（·）ds為加權弧長微元;g（·）為遞減邊緣檢測函數;s為弧長參數;θ為曲線法向量與梯度間夾角，（°）;SymbolQC@為梯度算子;N→為單位內向法線;α、β、γ為權重;λ1和λ2是大于零的權重系數，用來控制曲線內部和外部能量的比重，通常λ1=λ2=1。

對其進行一階變分為

δEδC=δε（φ）αdivgSymbolQC@φSymbolQC@φ-β·sign〈SymbolQC@I，N→〉ΔI+γ·-λ1I-c12+λ2（I-c2）2N→。（2）

c1=1ΩCΩCI（x，y）dxdy;c2=1Ω＼ΩCΩ＼ΩCI（x，y）dxdy。

式中：ΩC為內部區域ΩC面積;|Ω＼ΩC|為外部區域Ω＼ΩC面積。

采用EAR（C）計算演化曲線法向量與梯度內積，驅動演化曲線對邊緣進行檢測;EGAC（C）為變分水平集主動輪廓模型的正則項，在奇異點處進行劃分;C-V模型EMV（C，c1，c2）函數為了使圖像最優劃分，將模型進行極小變分處理。α、β、γ都是正實數，分別代表模型中的權重，取值越小，比重越低，反之越大。通過求ct=δE（C）δc的穩定解，則模型函數可取得極小值。

1.2.3 分割質量評價

分割質量定量評價的評價指標分別為分割誤差（R）、過分割誤差（OR）和欠分割誤差（UR），分割指標值越小，則表明圖像分割質量越好，目標分割越精確，詳見文獻。擬采用Photoshop軟件進行手動分割，擦拭出表皮細胞真實區域，將其作為上述3個指標的基準，其表達式如（3）—（5）所示。

R=A-A/A×100%。（3）

OR=A-（A∩A）/A-×100%。（4）

UR=A-（A∩A）/A×100%。（5）

式中：A為真實面積;A為目標面積;A-為A補集。

1.3 表皮細胞厚度測量

本文在充分分析表皮細胞圖像特點基礎上，采用Sobel算子進行快速行進骨架提取，首先利用快速行進骨架提取算法提取細胞骨架，Sobel確定細胞邊緣，利用高斯曲線擬合骨架，然后采用公式y=k1x+b做局部擬合中心線曲線的垂線，其中斜率k1與局部擬合中心線斜率k2滿足：k1=-1/k2，k2=-2a1（x-b1）c21e-（x-b1c1）2-2a2（x-b2）c22e-（x-b2c2）2-···-2an（x-bn）c2ne-（x-bncn）2，通過計算垂線與表皮細胞上下邊緣2交點間距離，多次結果均值即為表皮細胞平均厚度。2交點Mi、Ni確定原理為：骨架垂線上點為Mi，其坐標為（xm，ym），邊緣線上點為Ni，其坐標為（in，jn），當Mi、Ni兩點間距離D=（xm-in）2+（ym-jn）2=0或接近于0時，即2點重合，此時的坐標點即為骨架垂線與邊緣交點。

2 試驗與結果分析

2.1 試驗

（1）為驗證本文算法分割精度，從已拍攝的表皮細胞圖像中選擇×40圖像30幅，分別采用Lazy Snapping算法、GrabCut算法和變分水平集主動輪廓算法分割預處理后的圖像，比較分割效果及精度。

（2）為驗證本文算法測量精度，采用本文算法提取分割后的表皮細胞厚度平均值，將得到的圖上尺寸值除以對應比例11.51 px/um，轉換成實際尺寸。提取結果與ToupTek Toupview軟件交互測量均值進行對比，分析本文算法有效性。

（3）為驗證算法穩定性，從30幅與處理后的圖像中任選1幅，分別采用本文提出算法與交互測量法對表皮細胞厚度進行重復測量，重復次數為30。

2.2 結果與分析

（1）圖像分割如圖2所示，由2圖可知，表皮細胞圖像經基于幾何均值和三維塊匹配算法去噪后，一定程度抑制了噪聲，圖像質量得到顯著提高，3種算法分割效果如圖3所示，評價結果見表1。由圖3（a）和圖3（b）可知，采用Lazy Snapping算法、GrabCut算法對表皮細胞圖像分割效果較差，出現了較嚴重的漏分割現象，同時GrabCut算法出現了過分割，能量出現了外泄現象。由圖3（c）可知，采用基于變分水平集主動輪廓算法分割效果較好，目標分割較準確。

從表1可以發現，Lazy Snapping算法分割誤差（R）、過分割誤差（OR）和欠分割誤差（UR）分別為22.538%、6.368%和11.815%，所用平均時間為14.134 s。結果表明，Lazy Snapping算法運行速度最快，但分割效果最不理想。該算法引入了分水嶺算法對待處理圖像進行預分割，在一定程度上提高了分割效率。但利用分水嶺把圖像分成了若干個小塊，這些小塊顏色相似度很大，很難區分開來，很容易視為同一標記。然而采用Graph Cut算法進行分割，相較Lazy Snapping算法，運行速度要快很多，主要是因為該算法引入了“迭代估計”和“不完全標號”，從而減少交互操作量，一定程度上對分割效率有所提高。但參與顏色分類的只有主觀所標識的，并且不做進一步的細致劃分，對于真實圖像中的紋理、邊緣和相似的顏色等信息都被忽略了，諸多原因導致分割的結果穩定性和精細度差。從結果比較可看出，GrabCut算法比Lazy Snapping算法更準確，但所用時間要長一些。主要是因為GrabCut算法輪廓能量項相比其他2個算法定義更為準確，通過“迭代估計”和“不完全標號”，在一定程度上不需要十分精準的用戶交互工作。但該算法對圖像重疊像素和模糊邊界進行處理時，采用Border Matting算法造成了運行速度較慢，耗時較長。再來看一下變分水平集主動輪廓算法，相對于前面2個算法分割效果有著明顯提高，但所用時間較長。主要是因為該算法將邊緣檢測算子、測地線主動輪廓模型和C-V模型進行集成，采用基于水平集變分原理能量函數曲線進行演化，所以分割效果會有明顯的提高，但同時計算過程復雜性造成用時較長。

（2）基于快速行進骨架提取如圖4（a）所示，采用Sobel算子提取的邊緣如圖4（b）所示，將骨架和邊緣附于分割后的葉片表皮細胞圖像，如圖4（c）所示。由4圖可以看出，提取的骨架和邊緣精度較高，與表皮細胞基本吻合。采用高斯曲線擬合法擬合的骨架曲線如圖5（a）所示。

經分析，冪級數n=4時，擬合效果最佳，平均均方根誤差（RMSE）為0.775 5，隨著n值越大，擬合精度隨之提高，計算量也會有所增加。采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細胞輪廓交點Mi和Ni，結果如圖5（b）所示，骨架垂線上點為Mi坐標為（xm，ym），邊緣線上點為Ni坐標為（in，jn），通過計算Mi和Ni間距離D=（xm-in）2+（ym-jn）2，得出表皮細胞平均厚度，將本文算法提取的表皮細胞厚度值與交互測量值進行對比，結果見表2。由表2知，本文算法提取值與交互測量值間相對誤差為3.27%，均方根誤差為0.983，相對較小，結果較準確。

（3）對同一幅預處理后的狹葉錦雞兒表皮細胞圖像測量結果如圖6所示，方差見表3。由圖6和表3可知，采用本文算法穩定性較高，誤差為0.007，采用ToupTek Toupview軟件交互測量方法受主觀干擾較大，數據出現了較大的波動，誤差為1.268。

3 結論

本文以狹葉錦雞兒葉切片表皮細胞圖像為研究對象，針對交互表皮細胞厚度測量主觀干擾大、穩定性差和效率不高等問題，通過采用基于幾何均值和三維塊匹配算法去除圖像噪聲，提出采用基于變分水平集主動輪廓算法對去噪后表皮細胞圖像進行分割，通過計算表皮細胞骨架曲線局部擬合中心線的垂線與表皮細胞上下邊緣2交點間距離，實現了表皮細胞厚度的測量，通過試驗得出以下結論。

（1）采用基于幾何均值和三維塊匹配算法可有效去除圖像噪聲，圖像質量得到明顯改善。本文提出的基于變分水平集主動輪廓算法對去噪后表皮細胞圖像可實現較準確分割，相較傳統Lazy Snapping算法和Grab Cut算法，雖然本文分割算法耗時最大，但分割效果最好，R、OR和UR平均值分別為5.670%、0.589%和5.900%，平均耗時為30.228 s。

（2）采用基于快速行進骨架提取算法提取和Sobel邊緣提取算法提取的骨架和邊緣精度較高，采用冪級數n=4時的高斯曲線擬合法骨架效果最佳，平均均方根誤差（RMSE）為0.775 5，隨著n值越大，擬合精度隨之提高，計算量也會有所增加。通過采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細胞輪廓交點Mi和Ni，通過不斷計算Mi和Ni間的距離得出表皮細胞厚度，通過與交互測量值的比較得出，本文算法提取值與交互測量值間相對誤差為3.27%，均方根誤差為0.983，相比之下其誤差相對較小，結果較為準確。

（3）通過對同一幅圖像30次重復測量后發現，相較ToupTek Toupview軟件交互測量方法，本文算法穩定性較高，誤差為0.007。

【參 考 文 獻】

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