松材線蟲Bx-TIMP克隆及功能研究

楊帆 零雅茗 舒紅 姜生偉 王佳楠 李丹蕾

摘 要：為探究Bx-TIMP基因在松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）致病過程中的功能，對Bx-TIMP基因進行克隆及分析，并驗證基因沉默后松材線蟲致病性變化。PCR法克隆Bx-TIMP，應用TMHMM 2.0 server和SignalP 4.1 Server分析該基因編碼蛋白質的跨膜結構域和信號肽;應用原位雜交技術確定該基因在松材線蟲體內表達部位;應用RNAi技術，分析沉默該基因后松材線蟲對紅松（Pinus koraiensis）致病性變化。該基因CDS區全長363 bp，編碼120個氨基酸，編碼蛋白具有跨膜結構域及信號肽。原位雜交表明該基因在松材線蟲食道腺中表達。基因沉默后，松材線蟲對紅松致病性減弱。結果表明，Bx-TIMP為效應因子基因，與松材線蟲致病性相關。本研究揭示Bx-TIMP基因是松材線蟲危害松樹致使其發病的關鍵基因，為進一步明確松材線蟲致病機理提供理論依據，為研發松材線蟲的防治技術奠定理論基礎。

關鍵詞：松材線蟲;致病性;效應因子;紅松;基因沉默

中圖分類號：S763.18??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）02-0014-06

Cloning and Functional Analysis of Bursaphelenchus xylophilus Bx-TIMP

YANG Fan1，2， LING Yaming1，2，5， SHU Hong3， JIANG Shengwei3，4， WANG Jianan1，2， LI Danlei1，2，4*

（1.School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China; 2.Key Laboratory of Alien Forest

Pest Monitoring and Control - Heilongjiang Province， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

3.Liaoning Provincial Station of Forest and Grassland Pest Control and Quarantine， Shenyang

110001， China; 4.Liaoning Provincial Key Laboratory of Dangerous Forest Pest Management

and Control， Shenyang Institute of Technology， Shenyang 113122， China; 5.Shiwandashan

National Nature Reserve Administration， Fangchenggang 535500， China）

Abstract：To explore the function of the gene Bx-TIMP during Bursaphelenchus xylophilus infecting Pinus sp.， Bx-TIMP was cloned and analyzed， then the gene was silenced by RNAi and vitrificated. The transmembrane domain and signal peptide of the protein encoded by Bx-TIMP was analyzed by TMHMM 2.0 server and SignalP 4.1 Server. The expression site of the gene in B. ylophilus was determined by in-situ hybridization. By silencing the gene with RNAi， the pathogenicity of B. xylophilus to P. koraiensis was analyzed. The gene had a total length of 363 bp and encoded 120 amino acids. The protein encoded by Bx-TIMP had a transmembrane domain and signal peptide and the results of in-situ hybridization showed that the gene was expressed in the esophageal gland of B. xylophilus， which accorded with the characteristics of effectors. The symptoms of P. koraiensis in Bx-TIMP-RNAi group were significantly weaker than those in the control group. This study showed that Bx-TIMP was an effector gene， which was related to the pathogenicity of B. xylophilus. This study revealed that Bx-TIMP gene is the key gene of B. xylophilus endangering pine trees， which provided a theoretical basis for further clarifying the pathogenesis of B. xylophilus and laying a theoretical foundation for the development of control technology of B. xylophilus.

Keywords：Bursaphelenchus xylophilus; pathogenicity; effect factor; Pinus koraiensis; RNAi

0 引言

與寄主互作時，病原分泌效應因子抑制寄主模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）而觸發的先天免疫，促進病原成功侵染寄主。植物寄生線蟲（plant parasitic nematodes，PPNs）通過口針將食道腺體分泌的效應因子導入寄主細胞中，以完成寄生過程并從寄主細胞中獲取營養。效應因子有助于線蟲在寄主體內成功取食、繁殖和遷移，促進線蟲侵染和寄生。目前，線蟲效應因子的研究大都集中在固著性內寄生線蟲：胞囊線蟲（Heterodera sp.）和根結線蟲（Meloidogyne sp.）中。

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是引起松樹萎蔫病（pine wilt disease，PWD）的一種遷徙性內寄生線蟲。松樹萎蔫病是對松樹極具破壞性的病害之一，導致每年約500萬m3的木材損失。在中國，松材線蟲最早于1982年在南京中山陵發現。松材線蟲與寄主植物的互作是由食道腺分泌的效應因子介導的，一些已知的效應因子可以修飾寄主植物的細胞，促進松材線蟲營養物質的攝入以維持生長和發育，還有一些效應因子可以改變寄主植物的信號通路，抑制植物的防御反應。對松材線蟲效應因子的研究對了解寄生機制和開發新的松材線蟲的防治措施具有重要意義。

根據實驗室前期研究結果，通過轉錄組數據分析篩選到效應因子組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）基因Bx-TIMP。TIMPs是一個保守的蛋白家族，是基質蛋白的特異性抑制劑，主要有4種亞型（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4）。TIMPs整體呈楔形，可直接與MMPs的活性間隙1∶1結合發揮效應，調節MMPs的活性，其N端和C端結構域分別由125和65個氨基酸構成，每個氨基酸都包含3個保守的二硫鍵，其中N端結構域的單獨單元折疊是發揮抑制MMPs效應的主要結構。哺乳動物TIMPs已被證明在體外和器官培養系統中負調控基質金屬蛋白酶的活性，也負調控體外聚蛋白多糖酶的活性。目前，尚未見松材線蟲TIMPs研究報道。本研究探究Bx-TIMP基因在松材線蟲致病過程中的功能，為進一步明確松材線蟲致病機理提供理論依據，為研發松材線蟲的防治技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 Bx-TIMP基因克隆及分析

Trizol法提取松材線蟲總RNA，并通過反轉錄試劑盒獲得松材線蟲cDNA。根據轉錄組測序結果設計涵蓋Bx-TIMP完整編碼蛋白區（coding sequence，CDS）的PCR引物，（Bx-TIMP-F序列：5′-CGCGAAAATCGTCAACCTCG-3′;Bx-TIMP-R序列：5′-GCGGTGCTGTTCAATTCCTC-3′）以植食松材線蟲cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物進行TA克隆，克隆后的基因產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

應用TMHMM 2.0 server對Bx-TIMP編碼蛋白質進行跨膜結構域的預測，應用SignalP 4.1 Server進行Bx-TIMP信號肽分析。

1.2 Bx-TIMP原位雜交

提取含有相應目的片段的質粒，應用Roche DIG RNA Labeling Kit （SP6/T7）分別合成正義及反義RNA探針。應用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I （Roche）進行雜交及信號檢測。將雜交顯影后制成的玻片置于Olympus BX51顯微鏡下拍照。

1.3 Bx-TIMP RNAi及接種驗證

用浸泡法對松材線蟲進行RNAi干擾。準備10 000條松材線蟲（混合蟲齡），以Bx-TIMP基因的siRNA（5′-AUAUUCCGCAAAGUCCAUCCUCGGC -3′）浸泡處理后，用M9緩沖液清洗回收線蟲，為Bx-TIMP-RNAi組。無靶基因序列siRNA（5′-AGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCU -3′）處理的線蟲為CK組。每組設3個重復。應用GoTaq2-Step RT-qPCR System試劑盒，分別提取Bx-TIMP-RNAi組及CK組線蟲總RNA進行Q-PCR擴增（Pri-R：5′-TCTGCCCACTACGGTCTACA-3′;Pri-F：5′-ACCCCCAGTATTTTCATCTCTGA-3′），驗證基因沉默效果，兩獨立樣本t檢驗差異顯著性。

用Bx-TIMP-RNAi組線蟲、CK組線蟲和ddH2O分別接種于紅松（Pinus koraiensis）3年生松苗，處理后連續觀察癥狀并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 Bx-TIMP基因克隆及結構域分析

TRIzol法提取松材線蟲總RNA，0.8%凝膠電泳檢測RNeasy Minikit column（Qiagen， cat. No. 74 104）純化后的RNA如圖1（a）所示，純度由BioPhotometer D30（Eppendorf， Hamburg， Germany）鑒定，OD值（OD260/OD280=1.9，OD260/OD230>1.7）符合要求。

以植食線蟲總RNA反轉錄為cDNA模板進行PCR擴增，擴增產物TA克隆后獲得基因產物送由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序得到Bx-TIMP基因片段長度363 bp，如圖1（b）所示。

在NCBI（National Center for Biotechnology Information）中比對同源序列，如圖1（c）所示，篩選到12條同源序列的保守結構域分析均為TIMP結構域，如圖1（d）所示。以擬禾本科根結線蟲（Meloidogyne graminicola）為內參，方頭恐猛蟻（Dinoponera quadriceps）為外參，以這12條同源序列構建系統發育樹，如圖1（e）所示。

進一步對該基因信號肽及結構域進行驗證，結果表明，Bx-TIMP編碼的蛋白質具有信號肽（圖2（a））和跨膜結構域（圖2（b）），均符合效應因子特征。

2.2 Bx-TIMP原位雜交

原位雜交結果顯示在線蟲食道腺上檢測到Bx-TIMP基因信號標記（圖3）。線蟲的食道腺、性腺和側尾腺是線蟲效應因子分泌部位，以食道腺為主， Bx-TIMP原位雜交結果表示該基因符合線蟲效應因子基因表達特點。

2.3 Bx-TIMP RNAi及接種驗證

使用熒光顯微鏡檢測RNAi組線蟲體內由FAM標記的dsRNA，松材線蟲通體顯示綠色熒光，表明dsRNA已成功進入線蟲體內（圖4（a））。Q-PCR檢測顯示，RNAi組Bx-TIMP基因表達下調（圖4（b））說明Bx-TIMP基因RNAi效果顯著，CK組無明顯變化。

根據接種后紅松發病情況（圖4（c）），連續觀察1～33 d，直至33 d觀察結束，RNAi組癥狀為少數松樹針葉局部褪綠，病株均仍未完全枯萎死亡。CK組癥狀為所有針葉黃化。ddH2O處理組紅松無癥狀。

3 結論與討論

本研究通過克隆TIMPs相關基因Bx-TIMP并進行分析，該基因編碼的蛋白質具有跨膜結構域及信號肽，原位雜交試驗表明該基因于松材線蟲食道腺中表達。將該基因沉默后，松材線蟲對紅松的致病性降低。因此確定該基因為效應因子基因，該基因編碼的效應因子可促進松材線蟲侵染松樹。

TIMPs除了抑制MMPs活性還有其他作用，如生長因子活性、類固醇生成和細胞形態調節。秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）通過TIMP-1調節性腺發育促進其繁殖。Bx-TIMP為組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）基因，可能通過特異性抑制植物基質金屬蛋白酶（MMPs）活性對植物防御反應產生影響，但該基因影響松材線蟲致病性的作用機理還需深入研究。本研究通過RNAi技術沉默該基因后接種紅松驗證其功能，Bx-TIMP基因沉默后松材線蟲的致病性降低，表明該基因與松材線蟲致病性有關，結合效應因子在松材線蟲抑制植物防御反應中的重要作用可知，Bx-TIMP在松材線蟲致病性中起關鍵作用，能夠成為松材線蟲防治的靶標基因，有效降低松材線蟲致病性，為松材線蟲的防治提供理論基礎。

【參 考 文 獻】

HUSSEY R S. Disease-inducing secretions of plant-parasitic nematodes. Annual Review of Phytopathology， 1989， 27： 123-141.

ROSSO M N， HUSSEY R S， DAVIS E L， et al. Effectors in plant-microbe interactions. Oxford， UK： Wiley-Blackwell， 2011.

HAEGEMAN A， MANTELIN S， JONES J T， et al. Functional roles of effectors of plant-parasitic nematodes. Gene， 2012， 492（1）： 19-31.

BIRD D M， JONES J T， OPPERMAN C H， et al. Signatures of adaptation to plant parasitism in nematode genomes. Parasitology， 2015， 142（Suppl 1）： S71-S84.

王步勇，問榮榮，李秀偉，等.松材線蟲谷胱甘肽S轉移酶Sigma1基因（BxGSTs1）克隆及表達分析.中南林業科技大學學報，2021，41（4）：156-164.

WANG B Y， WEN R R， LI X W， et al. Cloning and expression analysis of glutathione s-transferase gene BxGSTs1 in Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Central South University of Forestry & Technology， 2021，41（4）：156-164.

REHMAN S， GUPTA V K， GOYAL A K. Identification and functional analysis of secreted effectors from phytoparasitic nematodes. BMC Microbiology， 2016， 16： 48.

JONES J D G， DANGL J L. The plant immune system. Nature， 2006， 444（7117）： 323-329.

HUANG X， HU L J， WU X Q. Identification of a novel effector BxSapB3 that enhances the virulence of pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 2019， 51（10）： 1071-1078.

許佳瑤，陳俏麗，張瑞芝，等.松材線蟲Bx-ubc-3基因克隆及泛素通路鑒定.森林工程，2019，35（5）：9-15.

XU J Y， CHEN Q L， ZHANG R Z， et al. Genetic cloning of Bx-ubc-3 and identification of ubiquitin pathway from Bursaphelenchus xylophilus（Aphelenchida： Aphelenchoididae）. Forest Engineering， 2019， 35（5）： 9-15.

CHEN Q， ZHANG R， LI D， et al. Genetic characteristics of Bursaphelenchus xylophilus third-stage dispersal juveniles. Scientific Reports， 2021， 11（1）： 3908.

陶佳慧，肖煒，楊偉，等.計劃燒除對松材線蟲的影響.中南林業科技大學學報，2021，41（11）：65-72.

TAO J H， XIAO W， YANG W， et al. Effects of prescribed burning on Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Central South University of Forestry & Technology， 2021，41（11）：65-72.

LIU Q， WEI Y， XU L， et al. Transcriptomic profiling reveals differentially expressed genes associated with pine wood nematode resistance in Masson pine （Pinus massoniana lamb.）. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 4693.

HU L J， WU X Q， LI H Y， et al. An effector， BxSapB1， induces cell death and contributes to virulence in the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2019， 32（4）： 452-463.

ESPADA M， DEN AKKER S E V， MAIER T， et al. STATAWAARS： a promoter motif associated with spatial expression in the major effector-producing tissues of the plant-parasitic nematode Bursaphelenchus xylophilus. BMC Genomics， 2018， 19（1）： 553.

高景斌，徐六一，葉建仁，等. 馬尾松松材線蟲病抗性無性系的篩選和遺傳多樣性分析. 南京林業大學學報（自然科學版）， 2021， 45（5）： 109-118.

GAO J B， XU L Y， YE J R et al. Growth and genetic diversity analysis of clones screened by phenotypical resistant to pine wilt disease inPinus massoniana.Journal of Nanjing Forestry University （Natural Science Edition）， 2021， 45（5）： 109-118.

FLINN B S. Plant extracellular matrix metalloproteinases. Functional Plant Biology， 2008， 35（12）： 1183-1193.

BREW K， DINAKARPANDIAN D， NAGASE H. Tissue inhibitors of metalloproteinases： evolution， structure and function. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） -Protein Structure and Molecular Enzymology， 2000， 1477（1/2）： 267-283.

FATA J E， HO A T， LECO K J， et al. Cellular turnover and extracellular matrix remodeling in female reproductive tissues： functions of metalloproteinases and their inhibitors. Cellular and Molecular Life Sciences， 2000， 57（1）： 77-95.

JACKSON H W， DEFAMIE V， WATERHOUSE P， et al. TIMPs： versatile extracellular regulators in cancer. Nature Reviews Cancer， 2017， 17（1）： 38-53.

ISLAM S， CHUENSIRIKULCHAI K， KHUMMUANG S， et al. Accumulation of versican facilitates wound healing： implication of its initial ADAMTS-cleavage site. Matrix Biology， 2020， 87： 77-93.

HASHIMOTO G， AOKI T， NAKAMURA H， et al. Inhibition of ADAMTS4 （aggrecanase-1） by tissue inhibitors of metalloproteinases （TIMP-1， 2， 3 and 4）. FEBS Letters， 2001， 494（3）： 192-195.

KASHIWAGI M， TORTORELLA M， NAGASE H， et al. TIMP-3 is a potent inhibitor of aggrecanase 1 （ADAM-TS4） and aggrecanase 2 （ADAM-TS5）. Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（16）： 12501-12504.

WANG W M， GE G X， LIM N H， et al. TIMP-3 inhibits the procollagen N-proteinase ADAMTS-2. The Biochemical Journal， 2006， 398（3）： 515-519.

零雅茗.松材線蟲3條效應因子基因克隆.哈爾濱：東北林業大學，2018.

LING Y M. The cloning of 3 Bursaphelenchus xylophilus effector genes. Harbin： Northeast Forestry University， 2018.

WOESSNER J F JR. MMPs and TIMPs-an historical perspective. Methods in Molecular Biology （Clifton， N J）， 2001， 151： 1-23.

KUBOTA Y， NISHIWAKI K， ITO M， et al. The role of tissue inhibitors of metalloproteinases in organ development and regulation of ADAMTS family metalloproteinases in Caenorhabditis elegans. Genetics， 2019， 212（2）： 523-535.