金銀木松散型胚性愈傷組織的誘導

許丁帆 劉艷軍 何遠秦 黃俊軒 武春霞 李建科

摘 要：為建立金銀木松散型胚性愈傷組織培養體系，該文研究金銀木不同外植體、不同植物激素配比對金銀木松散型胚性愈傷組織誘導與繼代保持的影響。結果表明，金銀木葉片為誘導愈傷組織最適外植體;葉片在MS（Murashige & Skoog Basal Medium，MS基礎培養基）+0.5 mg/L BA（Benzylaminopurine，芐氨基腺嘌呤）+1.0 mg/L 2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸，）培養基上可誘導出松散型愈傷組織，愈傷組織誘導率達100%;將松散型愈傷組織轉接到MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D培養基上，每20 d繼代培養一次，繼代培養2～3次后可獲得金銀木松散型胚性愈傷組織。

關鍵詞：金銀木;葉片;松散型胚性愈傷組織;培養基;激素

中圖分類號：S793.9? ????文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）02-0027-07

Induction of Loose Embryogenic Callus of Lonicera maackii

XU Dingfan， LIU Yanjun*， HE Yuanqin， HUANG Junxuan， WU Chunxia， LI Jianke

（College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract：In order to establish the culture system of loose embryogenic callus of Lonicera maackii， the effects of different explants and different plant hormone ratio on the induction and subculture maintenance of loose embryogenic callus were studied. The results showed that the leaf of L.maackii was the most suitable explant for callus induction; loose callus could be induced from the leaf of L.maackii on the medium of MS （Murashige & Skoog Basal Medium） +0.5 mg/L BA （Benzylaminopurine） +1.0 mg/L 2，4-D （2，4-Dichlorophenoxyacetic acid）， and the callus induction rate reached 100%; the loose callus were transferred to the medium of MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D， and subcultured every 20 days， the loose embryogenic callus were obtained after subculture for 2-3 times.

Keywords：Lonicera maackii; leaf; loose embryogenic callus; culture medium; hormones

0 引言

金銀木（Lonicera maackii （Rupr.） Maxim.）又名金銀忍冬，忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）落葉灌木或小喬木，生性強健，耐旱、耐寒，適應性強，對土壤要求不嚴，具有較強的重金屬富集能力和空氣凈化能力，被廣泛應用于園林綠化中，是華北地區重要的觀花、觀果樹種之一。此外，金銀木在醫療、食品及化妝品等產業均有較高的開發應用價值。當前，金銀木苗木繁殖主要以播種和扦插繁殖為主，也可通過壓條和嫁接等方式進行繁殖。但常規繁殖方式速度慢、效率低。

隨著植物組織培養技術的發展，體細胞胚胎發生已逐漸成為植物大規模繁殖的主要方式，具有繁殖系數高、遺傳穩定等優點。同時，利用體細胞胚胎發生技術和胚性愈傷組織的超低溫保存技術，可實現優良種質資源的規模化生產和長期保存。而優質的胚性愈傷組織是體細胞胚胎發生的關鍵，是大規模植株再生的基礎，是遺傳轉化的重要材料，也是研究植物單細胞分化和基因全能性表達的理想材料。

目前國內外對金銀木的研究主要集中在有效成分提取和栽培等方面，對金銀木組織培養方面的研究報道較少，僅在組培快繁方面進行了一定的研究，未見金銀木愈傷組織誘導的相關研究報道。關于忍冬屬植物的愈傷組織研究報道較多，如金銀花（Lonicera japonica）、灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）等已開展細胞懸浮培養及其次生代謝物生產的相關研究，但至今尚未見忍冬屬植物胚性愈傷組織的有關研究報道。本試驗以金銀木不同外植體類型，通過調整培養基中激素的配比和用量，建立金銀木松散型胚性愈傷組織誘導體系，為進一步誘導金銀木體細胞胚胎發生奠定基礎，為金銀木體細胞離體誘變育種及次生代謝物生產等研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 外植體制備與消毒

選取天津農學院東校區內生長健壯、無病蟲害的金銀木植株，于4月上旬晴天的早晨，剪取腋芽未萌發的半木質化枝條，去除葉片和頂芽，保留葉柄，保濕帶回實驗室。將枝條置于自來水下沖洗10 min后，在超凈工作臺中，將枝條剪成2～3 cm 的帶腋芽莖段，70%乙醇溶液浸泡20 s，再用2%有效氯的次氯酸鈉溶液消毒4 min，消毒時不斷搖動。消毒后用無菌水浸泡3次，每次5 min，其間不斷搖晃。用無菌濾紙吸干莖段表面水分，并剪去兩端消毒損傷部分，接種至1/2MS（Murashige & Skoog Basal Medium）+2.5 mg/L GA3（赤霉素）培養基上誘導腋芽萌發。

1.2 松散型愈傷組織誘導外植體的篩選

在金銀木腋芽快速生長期，剪取長約0.5 cm的幼嫩莖段，莖段不帶生長點;選擇初展葉的葉片，剪成約0.5 cm×0.5 cm的小塊;葉柄帶葉片基部，長約0.5 cm，將外植體平置于愈傷組織誘導培養基表面。愈傷組織誘導培養基為MS+1.0 mg/L 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），每種外植體接種6瓶，每瓶接種5個外植體，重復3次。每天對接種材料進行觀察記錄，30 d后統計形成愈傷組織的外植體數，并計算愈傷組織誘導率。

1.3 松散型愈傷組織誘導激素配比的篩選

將葉片接種到不同的松散型愈傷組織誘導培養基上，誘導培養基以MS為基本培養基，分別添加不同質量濃度BA（芐氨基腺嘌呤）、2，4-D。每種誘導培養基接種6瓶，每瓶接種5個外植體，試驗重復3次。30 d后統計愈傷組織誘導率。

1.4 松散型胚性愈傷組織的誘導與繼代保持

選取誘導的松散型愈傷組織外部易剝離的部分，從外植體上切下，大小約為0.25 cm3，選擇生長狀態基本一致的接種至不同的胚性愈傷組織誘導培養基上。培養基采用MS為基本培養基，分別添加不同質量濃度的BA、2，4-D。試驗重復3次，每次重復接種10瓶，每瓶接種5塊愈傷組織。每20 d繼代培養一次，每次繼代培養時選擇結構松散、質地硬脆的新生愈傷組織，5次繼代培養后記錄愈傷組織生長速度、結構質地與顏色。每次繼代培養后鑒定愈傷組織胚性情況。

1.5 胚性愈傷組織細胞學的鑒定

取少量愈傷組織用卡寶品紅染液（Carbol fuchsin）或1%碘-碘化鉀溶液染色后壓片，使用Leica DM4000顯微鏡觀察愈傷組織的胚性情況。

胚性愈傷組織細胞較小，細胞核大，胞質濃，部分細胞可見分裂相;1%碘-碘化鉀溶液染色淀粉粒積累多。非胚性愈傷組織細胞大，形狀為圓形、橢圓形或不規則形狀，細胞核常偏向一側且細胞核較小，無分裂相細胞;1%碘-碘化鉀溶液染色淀粉粒積累少或沒有淀粉粒積累。

1.6 培養條件

以上培養基均采用100 mL廣口三角瓶為容器，每個三角瓶加入約40 mL的培養基。培養基均添加瓊脂 7.0 g/L、蔗糖30 g/L，滅菌前調節pH為5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。培養溫度為25 ℃±2 ℃，24 h光照，光照強度1 000～1 500 lx。

1.7 數據統計分析

愈傷組織誘導率=（形成愈傷組織的外植體數/外植體總數）×100%。

試驗數據采用excel 2013和SPSS Statistic 22.0進行數據分析，Duncans新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同外植體類型對愈傷組織誘導的影響

接種6～8 d后，大部分外植體傷口處出現黃白色愈傷組織，30 d后統計愈傷組織誘導率見表1。由表1可知，從愈傷組織結構與質地看，在MS+1.0 mg/L 2，4-D上，不同外植體誘導的愈傷組織無明顯差異。但從愈傷組織誘導率看，不同外植體類型形成愈傷組織的能力存在差異，其中葉片的愈傷組織誘導率最高，表明金銀木葉片的脫分化能力明顯高于莖段和葉柄。同時，葉片誘導的愈傷組織生長速度也快于莖段和葉柄誘導的愈傷組織。因此，葉片是誘導金銀木愈傷組織的理想外植體類型。不同外植體誘導愈傷組織情況如圖1所示。

2.2 不同激素配比對松散型愈傷組織誘導的影響

由表2可知，不添加植物激素的對照很難誘導出愈傷組織，葉片外植體在培養基中逐漸褐化，僅少數外植體邊緣出現極少量的點狀綠色愈傷組織。當培養基中添加一定質量濃度的2，4-D后，金銀木葉片愈傷組織誘導率顯著提高，說明2，4-D對金銀木愈傷組織的誘導影響顯著。同時，2，4-D能夠提高愈傷組織的生長速度，愈傷組織生長速度隨著2，4-D質量濃度的提高而加快。當2，4-D在較低質量濃度0.5 mg/L時，愈傷組織生長速度較快，結構松散但質地較軟，顏色呈白色，如圖2（a）所示;當2，4-D質量濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織生長速度變快，但誘導的愈傷組織仍為結構松散、質地較軟的白色愈傷組織;當2，4-D質量濃度增大至2.0 mg/L時，愈傷組織生長速度快，為質地稀軟的白色愈傷組織，如圖2（b）所示，且隨著培養時間的延長，愈傷組織出現部分褐化現象。當培養基中BA配合2，4-D使用時，愈傷組織質地與顏色發生較大變化。當0.5 mg/L BA配合較低質量濃度 0.5 mg/L 2，4-D時，愈傷組織結構松散，質地較硬，顏色呈黃色，如圖2（c）所示;當0.5 mg/L BA配合1.0 mg/L 2，4-D的激素時，愈傷組織結構松散，質地較硬，生長速度變快;當0.5 mg/L BA配合2.0 mg/L 2，4-D時，愈傷組織生長速度快、結構松散、質地較軟，如圖2（d）所示，說明當0.5 mg/L BA配合 2，4-D使用時，愈傷組織質地會隨著2，4-D質量濃度的增加而變軟。當0.5 mg/L 2，4-D配合不同質量濃度BA時，愈傷組織結構會隨著BA質量濃度的增加而變緊密，愈傷組織質地則隨BA質量濃度的增加而變硬。當激素質量濃度為0.5 mg/LBA+1.0mg/L 2，4-D時，葉片外植體誘導得愈傷組織結構松散、質地較硬，生長速度較快，愈傷組織組織誘導率達100%，為理想的金銀木松散型愈傷組織誘導培養基配方。

2.3 不同激素配比對胚性愈傷組織誘導與胚性保持的影響

將上步誘導的松散型愈傷組織轉接到胚性愈傷組織誘導培養基上，5次繼代培養時不同激素配比對胚性愈傷組織誘導與胚性保持效果不同，見表3。由表3可知，2，4-D對胚性愈傷組織誘導與胚性保持影響顯著，不添加2，4-D或2，4-D質量濃度過高或過低均不利于胚性愈傷組織誘導與胚性保持。培養基中只添加0.5 mg/L BA時，5次繼代培養均不能獲得胚性愈傷組織，且隨著愈傷組織繼代次數

的增加，愈傷組織結構變致密、質地變硬，顏色為深綠色，繼代培養1次如圖2（e）所示，繼代培養5次如圖2（f）所示。當0.5 mg/L BA配合1.0 mg/L 2，4-D時，經5次繼代培養，未能誘導出胚性愈傷組織，且愈傷組織質地隨著繼代次數的增加而逐漸變軟，顯微鏡觀察為無明顯細胞核結構的薄壁細胞，如圖3（b）所示。降低2，4-D質量濃度，愈傷組織逐漸向著胚性愈傷組織轉變，但胚性愈傷組織的胚性化程度與胚性保持情況差異明顯。當0.5 mg/L BA配合0.5 mg/L 2，4-D時，2次繼代培養后可誘導出胚性愈傷組織，但愈傷組織不能完全保持胚性，部分胚性愈傷組織細胞逐漸轉變為無明顯細胞核結構的薄壁細胞。當0.5 mg/L BA配合0.25 mg/L 2，4-D時，可誘導出胚性愈傷組織，2次繼代培養后經顯微鏡觀察均為胚性愈傷組織細胞，且在此激素配比的培養基上，經過5次繼代培養，松散型胚性愈傷組織可以穩定增殖且保持胚性。當0.5 mg/L BA配合0.1 mg/L 2，4-D時，5次繼代培養均是胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織同時存在，愈傷組織不能完全胚性化。因此，理想的金銀木松散型胚性愈傷組織誘導與胚性保持培養基配方為：MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D。

3 結論與討論

植物的體細胞經過重編程過程形成胚性愈傷組織，再從胚性愈傷組織細胞分化形成體細胞胚，這一過程為體細胞胚的間接發生途徑。胚性愈傷組織是體細胞胚間接發生途徑的前提。胚性愈傷組織的誘導受到母株基因型、外植體類型、培養基、激素和培養條件等諸多因素的影響。選擇適宜的外植體類型是誘導胚性愈傷組織的關鍵因子之一。蔣娜等誘導灰氈毛忍冬愈傷組織，得出其葉片的愈傷組織誘導率遠遠高于莖段的誘導率，且剛剛萌發的外植體更適合誘導愈傷組織。因此，不同類型或同一類型處于不同發育階段的外植體會直接影響愈傷組織誘導的結果。有研究表明，分生組織細胞和胚性細胞在組織學、形態學和超微結構上有許多相似之處。因此，含分生組織細胞多的外植體相對更容易誘導胚性愈傷組織。

植物生長調節劑是胚性愈傷組織誘導與保持的關鍵，其種類、質量濃度及配比決定了細胞發育的方向。在胚性愈傷組織誘導與增殖過程中往往同時添加生長素和細胞分裂素，適宜質量濃度的生長素與細胞分裂素配比能有效促進胚性愈傷組織的形成。本試驗以BA 配合2，4-D使用可誘導金銀木胚性愈傷組織，并發現2，4-D對胚性愈傷組織誘導與胚性保持影響顯著，不添加2，4-D及2，4-D質量濃度過高或過低均不利于胚性愈傷組織誘導與胚性保持。龔雪琴等認為，2，4-D和6-BA在誘導朱頂紅試管小鱗莖形成胚性愈傷組織和增殖繼代中起關鍵作用。而張煥玲等認為誘導栓皮櫟胚性愈傷組織最適宜的激素組合是NAA與BA 配合使用。說明不同植物對激素的反應不同。

本試驗在誘導金銀木胚性愈傷組織過程中發現，在胚性愈傷組織誘導的初始階段，大多數愈傷組織細胞不具備胚性，需要幾次繼代培養后才逐漸分化為胚性愈傷組織。這與李爽等發現荔枝葉片愈傷組織需進行繼代培養后才能誘導出胚性愈傷組織的結果相一致，可能是愈傷組織胚性化過程需要充足的養分和遺傳物質積累。

同時，非胚性愈傷組織與胚性愈傷組織之間可以相互轉換，其取決于所添加的激素種類及其質量濃度和愈傷組織本身的狀態。而非胚性細胞在生長上容易占據優勢，因此每次繼代培養時需結合愈傷組織的細胞學鑒定，選擇胚性愈傷組織進行繼代培養。

本試驗建立了金銀木松散型胚性愈傷組織誘導與保持體系，為金銀木大規模繁殖、體細胞離體誘變育種及遺傳轉化等研究奠定基礎。關于金銀木胚性愈傷組織的體細胞胚胎發生和超低溫保存等有待進一步研究。

【參 考 文 獻】

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