腎上腺素致慢性血瘀證大鼠模型的血漿代謝組學研究?

楊會珍， 胡 廣， 苗 蘭， 彭 勍， 任常英， 孫明謙， 林 力

(中國中醫科學院西苑醫院， 北京 100091)

血瘀證是指離經之血不能及時排出或消散而停留在人體的某部，或血液運行不暢瘀積于經脈或器官內所出現的證候，主要的致病因素為情志失調、痰凝和寒邪等。作為一種常見的中醫證候，血瘀證見于多種疾病如冠心病、子宮肌瘤等發生發展過程中。中醫認為氣為血之帥，氣行則血行、氣滯則血瘀。情志失調如憂思焦慮、狂躁大怒等，均可引起氣血運行失常和瘀血內停?，F代研究表明，在焦慮、抑郁等情緒狀態下人體的交感神經功能亢進，血液中腎上腺素和去甲腎上腺素分泌增加[1]，因此以往研究中多采用腎上腺素進行血瘀證的造模。

臨床上氣滯血瘀的形成是一個“久病成瘀”的長期過程，具有“久病”“慢病”的特點[2]。但文獻常見單次大劑量注射腎上腺素復合冰水刺激建立的血瘀模型[3，4]，該模型是一種急性應激模型，并不符合血瘀證在中醫理論上由氣機郁滯發展到血瘀的證候變化。本研究擬采用小劑量腎上腺素長期給藥的方法進行造模，模擬長時間焦慮抑郁導致慢性血瘀，更符合臨床致病特點。

代謝組學是系統生物學的一個重要分支，通過考察生物體受刺激擾動后其內源性代謝物種類、數量及變化規律來判斷機體狀態，目前已成為疾病診斷研究的重要手段[5]。本文擬應用代謝組學技術，對腎上腺素致慢性血瘀證大鼠模型進行研究，挖掘其生物標志物及相關代謝途徑，為揭示血瘀證的發病機制和藥物的研發提供依據。本研究通過中國中醫科學院西苑醫院實驗動物福利倫理委員會批準(批號2021XLC011-2)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠22只，體質量150～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0006。動物飼養于中國中醫科學院西苑醫院動物實驗中心屏障環境設施中，標準顆粒飼料及潔凈飲用水喂養，飼養環境為晝夜各半交替，溫度 18～22 ℃，通風良好，濕度恒定。

1.2 藥物、試劑與儀器

鹽酸腎上腺素注射液(1 mL，1 mg/支，天津金耀藥業有限公司，貨號2002031)；甲醇(貨號194253)和乙腈(貨號194063)均為色譜級，購自美國Fisher公司；甲酸(貨號17 M8207)，購自ROE SCIENTIFIC INC公司。

Q-ExactiveOrbitrap四級桿-靜電場軌道阱質譜儀并配有熱噴霧離子源(HESI)，Xcalibur4.1化學工作站，美國ThermoScientific公司；Vanquish超高效液相色譜系統(含二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱，DAD檢測器)，美國ThermoScientific公司；PL-12血小板分析儀，江蘇英諾華醫療技術有限公司；LBY-N6C全自動清洗血流變儀，北京普利生儀器有限公司；MilliporeSynergyUV型超純水機，美國Millipore公司；SartoriousBT25 S型萬分之一電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 分組與造模

22只大鼠隨機分為正常組和血瘀證模型組各11只，正常組不給予任何操作，血瘀證模型組大鼠背部皮下注射鹽酸腎上腺素溶液0.6 mg/kg，每日注射1次，連續注射1周。

2.2 樣本采集

取材前1 d所有大鼠均禁食12 h。造模第7天記錄大鼠體質量及體征變化，血瘀證模型組大鼠末次注射腎上腺素1 h后，3.5%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，抗凝后分別用于全血黏度(低切5 s-1，中切60 s-1，高切150 s-1)和ADP(adenosine diphosphate，二磷酸腺苷)誘導的血小板聚集率的測定，剩余肝素化抗凝血漿置于-80 ℃凍存，用于代謝組學研究。

2.3 代謝組樣品制備

凍存血漿在室溫下解凍，精密吸取各組樣本50 μL，分別加入200 μL冷有機溶液(乙腈：甲醇=1∶1)，渦旋混合，4 ℃ 16500 g離心12 min，取上清液進行分析。

2.4 液質條件

液相條件：色譜分離采用Thermo Scientific的U3000快速液相色譜，使用反相色譜對血漿樣本進行分析。液相分離采用色譜柱：Waters UPLC BEH C18(1.7um 2.1 mm×100 mm)。流動相A相為0.1%甲酸的乙腈液, B相為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫，25% B；0～10 min，90 %B；10～11 min，90%B；11～13 min，25%B，14 min停止。2針之間平衡時間為1 min。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，樣品室溫度為4 ℃，進樣量5 μL。

質譜條件為正負離子檢出模式，離子源溫度350 ℃，噴霧電壓3.5 KV，S-LensRF電壓60 V，毛細管溫度300 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速35arb，輔助氣流速10arb。數據采集采用一級全掃描(數據采集范圍100～1200 m/z)與數據依賴性二級質譜掃描，碰撞模式采用高能量碰撞解離(high energy collision dissociation，HCD)。

2.5 數據處理與分析

利用Xcalibur 2.1工作站進行數據處理，采用CompoundDiscoverer2.0軟件對具有精確分子量的MS1和MS2質譜數據進行mzCloud譜圖匹配和Chemspider、HMDB以及Kegg Pathways等數據庫搜索，參數為MS1質量精度<5ppm，譜庫搜索算法為High Chem Low+High Res，打分匹配閾值>60(越高匹配越準確，最高為100)，搜索過程中進行同位素匹配以及背景噪音扣除等處理。未被指認的代謝產物進一步進行Metlin等二級譜圖搜庫。本實驗中質控(quality control，QC)樣本由等量的不同樣本混合制成，在液質分析過程每6個樣本進1個QC樣本。為保證樣品檢測中的準確性，實驗中QC的變異系數(coefficient of variation，CV)值小于30%作為質譜檢測到成分的篩選標準，大于30%的變量不進入下一步分析。

將所得樣品數據導入網絡在線分析軟件MetaBoanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)，采用無監督的主成分分析(principal components analysis，PCA)和有監督的偏最小二乘法(partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA)進行模式識別分析，通過PLS-DA的變量投影重要性(ariable importancein projection，VIP)值，篩選變化顯著的差異代謝物，并將找到的差異代謝物導入HMDB(humanmetabolome databatabase)和KEGG(kyotoencyclopedia of genes and genomes)數據庫進行檢索和確認，最終鑒定出與血瘀證相關的生物標志物。

3 結果

3.1 各組大鼠證候變化

血瘀證模型組大鼠懈怠懶動，皮毛疏松粗糙，毛色發黃無光澤，進食量減少，大便溏爛，弓背，反應遲鈍，體質量下降明顯(表1)。正常組大鼠毛色有光澤，食欲正常，好動，反應靈敏。

表1 正常組與血瘀證模型組大鼠造模前后體質量比較

3.2 各組大鼠血液流變學和血小板聚集水平比較

表2、3示，與正常組比較，血瘀證模型組大鼠的全血黏度在不同切變率下均顯著升高(P<0.01)，血小板聚集率也顯著增加(P<0.01)，表明造模后大鼠血液黏滯，凝血功能活躍，血瘀證大鼠造模成功。

表2 正常組與血瘀證模型組大鼠不同切變率下全血黏度比較

表3 正常組與血瘀證模型組大鼠血小板聚集率比較

3.3 數據分析

為更直觀地分析注射腎上腺素對大鼠血漿樣本代謝物譜的影響，將正常組和血瘀證模型組大鼠的血漿代謝物譜分別采用PCA和PLS-DA進行模式識別，得到二者的模式識別圖(如圖1)。在正負離子模式下，模型組與正常組血漿樣本間均呈現出明顯的區別，說明大鼠造模后體內內源性小分子代謝物發生了明顯變化，表明慢性血瘀證模型造模成功。

注：A.血瘀證模型組與正常組的正離子主成分分析(principal components analysis，PCA)得分圖；B.血瘀證模型組與正常組的正離子偏最小二乘法(partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA，R2=0.949,Q2=0.868)得分圖；C.血瘀證模型組與正常組的負離子PCA得分圖；D.血瘀證模型組與正常組的負離子PLS-DA(R2=0.963,Q2=0.785)得分圖圖1 血瘀證模型組(M)和正常組(N)血漿樣本模式識別圖

3.4 潛在生物標志物的發掘與鑒定

本實驗主要發掘注射腎上腺素誘導血瘀證的生物標志物，篩選出對慢性血瘀證模型組和正常組的區分產生較大作用的成分，即為血瘀證血漿中的潛在生物標志物。根據 PLS-DA 模型的VIP值、變異系數(FC)分析、T檢驗進行篩選，以VIP>1、FC>1.5、P<0.05作為篩選標準，FC指血瘀證模型組相對于正常組的變化倍數。對篩選到的生物標志物進行聚類分析得到熱圖(如圖2)，可以看出正常組和血瘀證模型組能夠明顯區分且組內聚類良好，表明篩選得到的生物標志物較為可靠。

圖2 正常組與血瘀證模型組大鼠血漿差異代謝物熱比較

與正常組比較，在正負離子模式下血瘀證模型組共篩選出差異代謝物17種(見表4)，并與不同組別生物標志物強度進行了比較(見圖3)。與正常組比較，阿拉伯糖酸、戊?；掖减０芬约癓ysoPI(20∶4/0∶0)等成分含量上升，α-亞麻酸、?；侨パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、苯酚硫酸鹽、順烏頭酸、乳酸以及磷脂酰膽堿等成分含量下降。這些代謝產物主要參與膽汁酸代謝、α-亞麻酸代謝、色氨酸代謝和能量代謝等代謝通路。

圖3 正常組與血瘀證模型組生物標志物強度比較

表4 正常組與慢性血瘀證組大鼠的血漿差異代謝物比較

4 討論

血瘀證是中醫常見的一種證候，本研究采用長期小劑量注射腎上腺素模擬長期氣滯所致的慢性血瘀證，并以血液流變學及血小板聚集率作為指標進行驗證。

代謝組學的測定結果顯示，血瘀證模型組大鼠體內的?；侨パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸等膽汁酸類成分的含量發生了顯著變化。膽汁酸在體內具有重要的生理作用，不僅可以調節脂質代謝[6，7]，而且與腸道菌群的穩態密切相關，還參與膽固醇的吸收和排泄[8-11]。血瘀證模型組大鼠體內膽汁酸含量下降，能夠引起膽固醇代謝水平的紊亂，從而加劇血液黏度的變化。本實驗結果也發現，慢性血瘀證模型大鼠的脂質代謝紊亂，表現為磷脂類成分磷脂酰膽堿(PC，O-16∶1/2∶0)和鞘磷脂(SM，d18∶1/24∶1)含量顯著下降，可進一步導致能量代謝異常和炎性反應。血瘀證模型中出現的膽汁酸與脂質代謝異常都將進一步加劇血脂代謝紊亂，促進血瘀證的發展。

注射腎上腺素后，血瘀證模型組大鼠的硫酸吲哚酚(3-Indoxyl sulphate, IS)與苯硫酸酯(phenol sulfate, PS)含量顯著下降，這2種成分都是重要的腸道菌群代謝物。IS是色氨酸代謝的最終產物，膳食色氨酸在腸道菌群表達的色氨酸酶作用下轉化為吲哚及其衍生物，最終在肝臟中硫酸化為IS[12，13]。而IS的含量異常提示血瘀證形成后體內腸道菌群以及色氨酸的代謝受到了干擾。色氨酸代謝后能夠生成5-羥色胺，而5-羥色胺與情緒密切相關，具有抗抑郁、抗焦慮的作用，在外周組織5-羥色胺也與血管和平滑肌的收縮有關。因此IS含量下降提示，血瘀證患者除腸道菌群發生異常變化之外，色氨酸的代謝途徑也發生了變化，可能與其情志的變化密切相關。酪氨酸酚裂解酶將飲食中的酪氨酸轉變為苯酚[14]，后者在宿主肝臟中進一步代謝為PS，酪氨酸可以產生多巴胺，多巴胺是一種具有獎賞作用的神經遞質，與抑郁癥等疾病關系密切。這2種色氨酸與酪氨酸的腸源性代謝產物變化，提示氣滯血瘀模型大鼠腸-腦軸相關途徑可能出現紊亂，氣滯血瘀模型的情志變化可能與腸道菌群的變化密切相關。

此外，模型組大鼠馬尿酸的含量也出現了明顯下降。馬尿酸是苯甲酸與甘氨酸通過甘氨酸N-酰基轉移酶催化得到的酰基甘氨酸，同時也是一個與腸道菌群密切相關的內源性代謝成分[15]。腸道微生物群將多酚轉化為苯甲酸，在人體肝臟和腎臟中與甘氨酸結合后，苯甲酸又轉化為馬尿酸。本研究發現，氣滯血瘀模型大鼠的多個異常生物標志物都與腸道菌群密切相關，該模型中腸道菌群受到了較為明顯的影響。

在氣滯血瘀模型中，與能量代謝相關的小分子有機酸和脂肪酸也受到了干擾，如乳酸、順烏頭酸和3-羥基丁酸等成分代謝都出現了異常。乳酸是糖酵解的重要產物，順烏頭酸參與三羧酸循環，3-羥基丁酸可以通過酮體代謝產生能量。這些小分子成分在血液中的含量下降，提示能量代謝受到了干擾。血瘀證模型組大鼠α-亞麻酸、二十碳三烯酸與棕櫚烯酸含量也出現了顯著性降低，提示血瘀模型大鼠脂肪酸的代謝可能出現了異常[16]。長鏈脂肪酸是能量代謝的重要原料，通過肉堿穿梭系統轉移到線粒體進行beta氧化，生成二氧化碳和水并產生能量。其含量的下降可能提示該模型中線粒體能量代謝受到了抑制[17]。多個能量代謝相關的不同內源性成分變化，說明在血瘀形成過程中能量代謝的不同環節都發生了改變，提示血瘀證模型的能量代謝途徑受到了干擾。

綜上所述，本文采用LC -MS對長期小劑量皮下注射腎上腺素建立的大鼠慢性血瘀證模型進行代謝組學分析，與正常組比較，血瘀證模型組主要在膽汁酸代謝、甘油磷脂代謝、腸道菌群代謝和能量代謝等方面發生了紊亂。運用代謝組學方法尋找慢性血瘀證模型的生物標志物及相關代謝途徑，為臨床診斷及治療血瘀證提供了參考。