中華獼猴桃黃烷酮3- 羥化酶基因克隆及其生物信息學分析

徐雅雯，陳如意，張 樂，郭志平，李嘉誠，朱群茵

（1.麗水學院 生態學院，浙江 麗水 323000；2.麗水學院醫學院，浙江 麗水 323000）

中華獼猴桃（Actinidia chinensis），也稱奇異果，是一種品質鮮嫩、營養豐富、風味鮮美的水果。在植物內部的各種器官和組織中分布有不同含量的黃酮類化合物。而黃酮類化合物作為獼猴桃果實內主要的活性成分，也是果實中最主要的多酚類物質，具有多種生物和藥理活性，可以起到抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[1]。黃酮類物質合成途徑分支點的核心酶眾多，其中黃烷酮3- 羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）的主要作用為催化4，5，7，- 黃烷酮C 位的羥化，從而生成花青素、前花色素苷、黃酮醇的前體物質——二氫山奈素（dihydrok-aempferol，DHK）[2-3]。雖然F3H可以單獨調控代謝，但是在黃酮類化合物的合成過程中F3H常和該途徑查爾酮異構酶、查爾酮合成酶等合作[4-6]。F3H基因的克隆和代謝早已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）[7]、水稻（Oryza sativa）[3]和其他物種中有報道，但在中華獼猴桃中還沒有關于F3H基因克隆的報道。因此本研究采取RT-PCR 克隆中華獼猴桃F3H基因cDNA 序列并對其進行生物信息學分析，為進一步研究中華獼猴桃中F3H基因結構和功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

從麗水府前農貿市場購買重量相等、大小一致、形狀相似、成熟程度一致的新鮮中華獼猴桃。

1.2 中華獼猴桃總RNA 提取與反轉錄

總RNA 的提取參照梅曉宏[8]的方法。取新鮮中華獼猴桃果實在液氮中研磨成粉，加入異硫氰酸胍提取劑，再加入醋酸鉀、100%冰乙醇及1/10 體積的醋酸鈉，顛倒混勻，再加入水飽和酚及氯仿- 異戊醇，混勻，離心取上清；加入異戊醇，于-20 ℃沉淀，離心；加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，用適量的DEPC 水溶解RNA，隨后瓊脂糖凝膠電泳檢測。以提取得到的總RNA 為模板，采用碧云天BeyoRTTMⅢcDNA 合成預混液（5X）進行反轉錄，取Total RNA 1 μL、DEPC-treated Water 6 μL、BeyoRTTMⅢcDNA 合成預混液（5X）4 μL形成20 μL 的反應體系；隨后42 ℃下孵育30 min，80 ℃下孵育10 min，獲取cDNA 第一鏈。

1.3 中華獼猴桃F3H 基因cDNA 克隆

根據NCBI 數據庫中華獼猴桃F3H基因cDNA 序列（登錄號：FJ542819），分別設計上游引物：5’-GGGGGAGAGAGAGAGAGAGA-3’；下游引物：5’-CAATCTCAAACTTGGCATCCA-3’。反應條件為：94 ℃下預變性5 min；94 ℃30s，53 ℃30s，72 ℃60s，共33 個循環，最后在72 ℃下延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，切膠回收后送生工測序。

1.4 生物信息學分析

利用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測中華獼猴桃F3H基因cDNA 開放閱讀框；利用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預測中華獼猴桃F3H理化性質；利用ProP 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP-1.0/）分析中華獼猴桃F3H蛋白信號肽和前導肽。使用ClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）進行多序列比對；通過SWISSMODLE（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預測中華獼猴桃F3H蛋白三維結構。利用MEGA 6.0 采用鄰接法構建系統進化樹，1 000 次Bootstraps，其他參數均為默認值。

2 結果與分析

2.1 中華獼猴桃F3H 蛋白分子特征

中華獼猴桃F3H基因cDNA 序列包含1 364 個核苷酸，其中包括一個含有1 101 個核苷酸的開放閱讀框，可編碼366 個氨基酸（圖1）。對中華獼猴桃F3H蛋白的理化性質進行預測，結果顯示中華獼猴桃F3H分子質量為40.89 kDa，理論等電點為5.40。中華獼猴桃F3H蛋白中不含前導肽和信號肽（圖2）。

圖1 中華獼猴桃F3H 基因cNDA 及其編碼氨基酸序列

圖2 中華獼猴桃F3H 蛋白信號肽和前導肽預測

2.2 F3H 氨基酸序列對比

根據多序列比對可知，中華獼猴桃F3H蛋白含有5 個保守基序（圖3）。其中參與Fe2+的結合是基序4中的His218、Asp220 和基序5 中的His276。基序5 中的Arg286 和Ser288 參與2- 酮戊二酸的結合，這些保守基序也存在于其他植物F3H氨基酸序列中。而在基序2 和基序3 中，存在3 個被認為在F3H蛋白質的折疊過程中起重要作用的嚴格保守的脯氨酸（Pro148、204、207）。

圖3 中華獼猴桃F3H 與其他植物F3H氨基酸序列對比

2.3 同源性分析

同源性分析結果表明，中華獼猴桃F3H氨基酸序列與浙江紅山茶的一致性最高（90.22%），其次與楊梅的一致性為89.89%，與棗的F3H一致性最低（87.98%）。這與多序列比對的結果相一致（表1）。

表1 中華獼猴桃F3H 與其他植物一致性分析

2.4 中華獼猴桃F3H 蛋白結構分析

中華獼猴桃F3H蛋白的二級結構預測表明，該蛋白結構以α- 螺旋為主，占41.7%，其次為隨機卷曲，占36.9%，占比最低的是β- 折疊，為21.4%。獼猴桃F3H蛋白三維結構預測發現，該蛋白含有His218、Asp220 和His276 三個鐵離子結合位點以及兩個參與2-O- 酮戊二酸合成的結合位點（Arg286、Ser288）（圖4）。

圖4 中華獼猴桃F3H 蛋白三維結構

2.5 F3H蛋白的系統進化樹分析

系統進化樹結果顯示，中華獼猴桃F3H氨基酸序列與葡萄F3H氨基酸序列進化關系最為接近，同時與藤茶、棗、胡桃、川黔千金榆、栗、歐洲栓皮櫟的F3H氨基酸序列聚為一大簇，說明中華獼猴桃F3H在進化上的保守性（圖5）。

圖5 中華獼猴桃F3H 與其他植物F3H 的系統進化樹分析

3 討 論

隨著植物多酚化學和藥理學的不斷發展，人們慢慢認識到多酚類物質是具有獨特生理活性和藥理活性的天然產物[9]。黃酮類化合物作為一類多酚化合物，是植物中一類重要的有效成分，具有鎮靜、利尿和抗氧化和抗癌等重要作用[10]。F3H基因作為核心類黃酮花青素途徑的關鍵結構基因之一[11]，越來越受到人們的關注。因此本研究對中華獼猴桃F3H基因cDNA 進行了克隆和生物信息學分析。通過對中華獼猴桃F3H蛋白的預測，可知中華獼猴桃F3H蛋白中不含信號肽和前導肽，與其他植物的F3H蛋白相一致[12-13]。多序列對比結果表明，在氨基酸水平上，中華獼猴桃F3H與其他植物的F3H相似性較高，且中華獼猴桃F3H氨基酸中的5 個保守基序也包含了Fe2+結合基序和2- 酮戊二酸結合基序2 個在大多數植物F3H都有所涉及的保守基序[12-13]，進一步說明了該基因具有較高的保守性。分析系統進化結果顯示中華獼猴桃F3H與葡萄、藤茶、棗等親緣關系較近，而與荔枝、龍眼等親緣關系較遠，在一定程度上體現了植物形態上的分類學差異，這與紫肉甘薯（Ipomopea batatas）[14]和滇水金鳳（Impatiens uliginosa）[15]結果一致。本研究為調節中華獼猴桃F3H的活性以增加黃酮類化合物含量奠定基礎，為高黃酮中華獼猴桃新品種研發提供了基礎數據。