消巖湯通過WNT通路抑制肺腺癌A549細胞增殖、促進細胞凋亡的機制研究*

鄭旭 ，韓燕燕 ，顧麗麗 ，李翀

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

中國是世界上肺癌最多的國家，近年來肺癌發病率和病死率仍呈現不斷攀升的趨勢[1]。肺腺癌約占肺癌的50%，是肺癌最常見組織學類型，總體生存率較低[2]。肺為嬌臟，肺癌的病因病機以正虛之內因為主，外因為惡毒內侵，合而生變，終成癌變。治療上以扶正為主、解毒祛瘀。消巖湯可扶正固本，是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”中醫腫瘤治則基礎上依據現代藥理研究開發出的院內制劑，具有多種抗腫瘤活性，臨床治療效果較好[3-4]。但消巖湯調控腫瘤細胞的作用機制仍有待研究。本研究發現了消巖湯對肺腺癌細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響，以及消巖湯對WNT/β-catenin通路的調控作用。為消巖湯治療肺腺癌的機制研究提供了新思路。

1 實驗材料

1.1 細胞 人肺腺癌A549細胞購自ATCC。

1.2 試劑 中藥消巖湯（制劑號40019）是天津中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，由黃芪、太子參、夏枯草、姜黃、郁金、白花蛇舌草組成。其主要化學成分為黃芪多糖、太子參環肽、夏枯草皂苷、姜黃素、齊墩果酸、熊果酸等[5-10]。經嚴格回流提取，其終濃度為含生藥0.3 g/mL。中藥消巖湯10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，用0.22 μm過濾器除菌，用培養基稀釋成梯度濃度的溶液。

WNT通路激動劑SKL2001，WNT通路抑制劑XAV939，均購自美國Selleck.cn公司。CCK8（江蘇凱基生物技術股份有限公司，南京），聚合酶鏈式反應（RT-PCR）提取試劑盒及擴增試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，北京），凋亡試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京），雙熒光報告檢測試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司，北京），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（Roche Applied Science，美國）。

2 實驗方法

2.1 A549肺腺癌細胞培養 A549細胞使在含10%胎牛血清的RPMI-DMEM培養液中常規培養，細胞密度達80%～90%時進行實驗。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）檢測 將A549細胞接種在96孔板中，密度為1×108/L，設3個復孔，每孔100μL，培養24 h待細胞貼壁后，分別加入不同藥物，實驗分組 空白對照組 、梯度濃度消巖湯組（100、50、10g/L），梯度濃度 XAV939 組（10、5、1 μmol/L），梯度濃度SKL2001 組（20、10、50 μmol/L）、消巖湯（10 g/L）加SKL2001組（10 μmol/L），繼續培養 48 h后，取上清液60 μL到新的孔中，加入已經配置好的30 μL的LDH檢測工作液，避光孵育30 min，測定A值（490 nm）。LDH釋放率（%）＝培養液LDH含量/（培養液LDH含量＋細胞裂解液LDH含量）×100%。

2.3 CCK8法檢測 將A549細胞接種于96孔板中（5 000個/孔）。實驗分組對照組、為消巖湯組（濃度10g/L）、消巖湯（10g/L）加SKL2001組（10μmol/L），SKL2001 組 （10 μmol/L）、XAV939 組 （5 μmol/L）每孔 200 μL，對照組 加入 200 μL 培養基。培養 24、48、72 h后每孔加入20 μL CCK8溶液，37℃再孵育4 h后取出。檢測各孔吸光度（A值）波長為490 nm，實驗重復3次。

2.4 細胞凋亡率檢測 藥物處理細胞48 h后收集細胞，加入PBS把細胞濃度調整到2×106/mL，每組取1 mL的細胞懸液，1 000 r/min，離心半徑8 cm，4℃離心10 min，在細胞沉淀中用冰預冷PBS洗滌兩次，在細胞中加入緩沖液200 μL混合均勻，依次加入 5 μL 碘化丙啶（PI）和 5 μL 的膜聯蛋白V-FITC（Annexin V-FITC），避光環境，室溫，靜置15 min，加300 μL緩沖液，用流式細胞儀分析測定對照組、XAV939組、消巖湯組、WNT通路激動劑SKL2001組及消巖湯聯合SKL2001組的細胞凋亡率。實驗重復3次。

2.5 RT-PCR 檢測 β-catenin、c-myc、Bcl-2、Caspase-3表達情況 實驗分組為對照組、中藥組和XAV939組，給藥后48 h提取細胞RNA，檢測mRNA濃度，反轉錄（85℃ 45 min，4℃ 10 min）合成 cDNA。最后進行PCR擴增，根據RT-PCR試劑盒說明書，設定程序為：95℃預變性10 min，95℃變性 10 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 32 s，40個循環。內參基因為GAPDH，實驗重復 3 次，2－ΔΔCt法計算 DNA 水平。反應引物見表1。

表1 聚合酶鏈反應引物Tab.1 Polymerase chain reaction primers

2.6 WNT通路活性檢測 向各組細胞中共轉染WNT信號傳導通路活性報告基因質粒pGL3-OT或pGl3-OF，pRL-TK質粒為熒光素酶內對照質粒。轉染48 h后檢測報告基因表達情況。檢測最終值為各給藥組WNT通路活性比值與內對照的比值（WNT信號傳導通路活性以pGL3-OT/pGL3-OF比值表示，以內對照質粒組值作為對照值），所有實驗重復3次。

2.7 統計學分析 數據應用SPSS18.0軟件分析。數據資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 消巖湯抑制A549細胞增殖的效果及對LDH釋放的影響 為篩選最適給藥濃度，應用LDH檢測梯度濃度XAV939組、消巖湯組、SKL2001組細胞毒性。結果發現與對照組比較，10 μmol/L XAV939組，100 g/L和 50 g/L消巖湯組 及 20 μmol/L SKL2001組均具有顯著的細胞毒性（P＜0.01）。所以為排除細胞毒性影響，選擇藥物濃度為5 μmol/L XAV939，10 g/L 消巖湯，10 μmol/L SKL2001（圖 1A）進行后續實驗。CCK8檢測對照組、消巖湯組，消巖湯加SKL2001組、SKL2001組、XAV939組細胞存活率。SKL2001組與對照組比較，細胞存活率上升，說明SKL2001作用后，細胞增殖率升高。而消巖湯組、消巖湯+SKL2001組、XAV939組與對照組比較，均可抑制細胞存活率，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明3組均可以抑制細胞增殖。此外，消巖湯組細胞存活率明顯低于消巖湯+SKL2001組，表明消巖湯+SKL2001組對單獨消巖湯組細胞增殖的抑制有恢復作用（見圖1B）。

圖1 消巖湯抑制A549細胞增殖Fig.1 Xiaoyan Decoction inhibited the proliferation of A549 cells

3.2 消巖湯可促進腫瘤細胞凋亡 采用AnnexinVFITC/PI雙染法檢測A549細胞凋亡情況，消巖湯組、消巖湯+SKL2001組與對照組細胞晚期凋亡率、細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。結果表明，消巖湯組作用后細胞晚期凋亡明顯增多，而各組早期凋亡率無明顯差異。SKL2001組與對照組比較細胞晚期凋亡率減少，表明WNT通路激動劑SKL2001能夠抑制腫瘤細胞凋亡。消巖湯組與消巖湯聯合SKL2001組比較晚期凋亡率更高，表明消巖湯組促進細胞凋亡能力優于消巖湯聯合SKL2001組，SKL2001可以減弱消巖湯的促細胞凋亡作用。而消巖湯組與XAV939組比較晚期凋亡率更高，表明消巖湯組促進細胞凋亡能力優于XAV939抑制劑組。

表2 各組A549細胞凋亡率（±s）Tab.2 Apoptosis rate of A549 cells among groups（±s）%

表2 各組A549細胞凋亡率（±s）Tab.2 Apoptosis rate of A549 cells among groups（±s）%

注：與對照組 比較，*P＜0.05；與消巖湯組 比較，#P＜0.05。

組別 早期凋亡率 晚期凋亡率 細胞凋亡率對照組 0.032±0.005 0.160±0.003 0.193±0.005消巖湯組 0.040±0.003 0.515±0.042* 0.555±0.039*消巖湯+SKL2001 組 0.037±0.001 0.234±0.030*#0.271±0.029*#SKL2001 組 0.023±0.002 0.092±0.003*#0.115±0.004*#XAV939 組 0.042±0.001 0.488±0.032* 0.530±0.032*

3.3 WNT通路相關基因β-catenin、c-myc的表達 為探究消巖湯對WNT通路的作用。檢測了消巖湯組、WNT通路抑制劑XAV939組、對照組給藥48 h后β-catenin、c-myc的表達。結果消巖湯組、XAV939組與對照組比較，β-catenin表達明顯下調，均有統計學意義（P<0.05），各實驗組與對照組比較，c-myc表達明顯下調，差異均有統計學意義（P<0.05），說明消巖湯和XAV939均可以下調低β-catenin和c-myc表達，兩者作用效果無明顯差異。見圖2。

圖2 各組β-catenin、c-myc的DNA表達水平Fig.2 β-catenin and c-myc DNA expression levels in each group

3.4 消巖湯抑制WNT通路活性 轉染熒光素酶報告基因質粒以檢測WNT信號傳導通路的活性，消巖湯、XAV939給藥后WNT通路的活性顯著降低，見圖3。與對照組比較，WNT通路活性明顯降低（P<0.05）。該檢測明確了消巖湯可以降低WNT通路的活性，同時也佐證了RT-PCR實驗結果與WNT通路相關性。

圖3 各組中WNT通路活性表達情況Fig.3 Activity expression of WNT pathway in each group

3.5 凋亡相關基因Bcl-2、Caspase-3的表達 檢測了消巖湯和XAV939抑制劑給藥48 h后凋亡通路相關基因Bcl-2、Caspase-3的表達。結果消巖湯組、XAV939組與對照組比較，抗凋亡基因Bcl-2表達明顯下調，差異均有統計學意義（P<0.05），說明消巖湯和XAV939均可以顯著降低Bcl-2表達。各實驗組與對照組比較，Caspase-3表達明顯上調，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 各組中凋亡相關基因Bcl-2、Caspase-3的DNA表達Fig.4 DNA expression of apoptosis-related genes Bcl-2 and Caspase-3 in each group

4 討論

WNT經典通路又稱為Wnt/β-catenin通路，該通路激活后導致細胞質內β-catenin穩定并積累而不能被降解，進而進入細胞核內可激活下游靶基因的表達及轉錄等[11-12]。研究發現，在膀胱癌中，下調WNT通路可以提高癌細胞的化學敏感性[13]。基因表達圖譜分析表明，WNT信號傳導主要參與乳腺癌的擴散和轉移過程[14]。在結直腸癌中，異常的WNT信號對腫瘤干細胞的腫瘤發生和維持至關重要[15]。WNT通路抑制劑XAV939與紫杉醇聯合使用，可以通過抑制WNT信號傳導來抑制乳腺癌的轉移、血管生成和生長[16]。WNT通路抑制劑—2，4-二氨基喹唑啉，可以抑制胃癌的進展和轉移[17]。隨WNT/βcatenin信號在許多類型的癌癥中被激活被證實，WNT通路抑制劑也逐漸成為腫瘤治療新靶點[18-22].

近年來，無論是中藥單體還是中藥復方，在腫瘤治療中的作用越來越受到重視，其作用機制研究也越來越深入。研究發現人參皂苷Rh1可以通過WNT通路抑制肺腺癌A549細胞增殖[23]。靈芝三萜可以通過WNT通路調節下游靶蛋白 c-myc、Caspase-3，CyclinD-1表達，從而調節細胞周期和凋亡[24]。益肺逐積方通過下調EGFR、GPRR30蛋白表達水平，進而抑制人肺腺癌A549細胞增殖并誘導其發生凋亡[25]。消巖湯抗腫瘤機制可能是誘導腫瘤細胞凋亡[26]。

本課題根據“扶正、解毒、祛瘀”的肺癌治療原則，應用臨床經驗方劑“消巖湯”治療肺腺癌，該制劑抗腫瘤活性強，臨床應用廣泛[27]。其中，黃芪、太子參共為君藥，滋陰氣，扶正抗腫瘤；夏枯草、牡蠣、白花蛇舌草為臣藥，清熱解毒，軟堅散結；佐以姜黃、郁金行氣散結，活血解瘀。全方扶正抗癌、解毒祛瘀，全面調節，祛邪而不傷正[28]。

本研究首先證實了消巖湯具有抑制肺腺癌A549細胞增殖、促進其凋亡的生物學特點。為進一步驗證消巖湯可以通過WNT通路抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，應用消巖湯組聯合WNT通路激動劑進行重復實驗。首先采用CCK8測定對照組、XAV939組、SKL2001組、消巖湯組和消巖湯聯合SKL2001組細胞存活率，發現后者兩組均可以抑制腫瘤細胞增殖，但是消巖湯組細胞存活率明顯低于消巖湯聯合SKL2001組，說明消巖湯雖然可以抑制WNT通路活性，但是消巖湯聯合WNT通路激動劑SKL2001后，抑制WNT通路的活性減弱了，從而對腫瘤細胞的抑制增殖作用也削減了。進一步采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測各組 A549細胞凋亡率，發現早期凋亡率各組間無明顯差異。消巖湯組以誘導細胞晚期凋亡為主，且該組晚期凋亡率和細胞凋亡率均高于消巖湯聯合SKL2001組，說明消巖湯組促進腫瘤細胞凋亡的能力優于聯合組，推測聯合組通過恢復激活WNT通路降低了消巖湯的促腫瘤凋亡能力，進一步證實了消巖湯通過下調WNT通路促進A549細胞凋亡的藥理學效應。為進一步發現消巖湯對WNT信號轉導通路的作用方式和機制，在裂解肺腺癌A549細胞核后，選取了RT-PCR方法和WNT通路活性分析檢測核RNA的表達和WNT通路活性表達情況，結果發現對照組 A549細胞核β-catenin基因、c-myc基因表達較強；而經消巖湯作用48 h后，β-catenin、c-myc基因的表達均下調（P<0.05）。提示消巖湯可能通過抑制胞質內βcatenin蛋白入核，下調WNT信號轉導通路活性，進而減少下游靶基因c-myc的表達。WNT通路活性檢測也證實了消巖湯可以明顯降低WNT通路活性，其作用與WNT通路抑制劑XAV939組效果基本一致。此外，通過檢測各組凋亡相關基因Bcl-2、Caspase-3的表達，發現消巖湯可以顯著降低抗凋亡基因Bcl-2表達，上調Caspase-3基因表達。由此，推測消巖湯可能是通過阻止β-catenin入核，下調了WNT通路活性，抑制肺腺癌細胞增殖。通過抑制WNT通路后，進而下調下游靶基因c-myc表達，并通過對凋亡相關基因Bcl-2、Caspase-3的調控促進了細胞凋亡。

綜上，扶正祛瘀解毒法經典復方“消巖湯”對肺腺癌腫瘤細胞促凋亡和抗增殖作用明顯，且對WNT經典通路抑制作用突出，但是本研究對機制調節的探討尚不完善，仍有待進一步研究。