酶解水蛭地龍混合藥渣的工藝研究及其產(chǎn)物的抗凝活性評價

李淑楠 ，金慧 ，倪開嶺 ，于洋 ，李正 ，王娜

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，牡丹江 157000）

地龍和水蛭中因含有抗凝活性的化學(xué)物質(zhì)而廣泛用于預(yù)防高危性心血管疾病和治療多種栓塞及血栓[1-2]。在相關(guān)中成藥的生產(chǎn)過程中，往往是通過溶劑提取法、酶解法等技術(shù)對地龍和水蛭的活性物質(zhì)進(jìn)行提取[3]，再加工成不同劑型。這些方法普遍存在提取率低的問題[4]，使得地龍和水蛭的藥渣中尚含有未被充分提取的活性物質(zhì)、大量粗蛋白、少量粗多糖等營養(yǎng)成分，以及多種氨基酸和微量元素等[5]。在實際生產(chǎn)過程中，對地龍和水蛭藥渣的處理主要采取直接填埋或堆肥的方法。這不僅會造成資源浪費，還會因動物藥渣的腐敗而影響環(huán)境[6]。采用適當(dāng)方法，對地龍和水蛭藥渣進(jìn)行再次開發(fā)，不僅可以實現(xiàn)資源的充分利用，還能降低藥渣對環(huán)境的影響，提高藥廠的經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的研究價值。

1 儀器與材料

1.1 儀器 CP1003電子天平、AB135-S電子天平、AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；FE20實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ZWF-200恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器、DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；ZRD-7080全自動新型鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；LD-4臺式離心機（常州天瑞儀器有限公司）；移液槍（德國艾本德股份有限公司）；DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料 經(jīng)粉碎的水蛭地龍混合藥渣（某中藥廠提供）；0.9%氯化鈉溶液（河北應(yīng)天成藥業(yè)股份有限公司）；酸性蛋白酶（泰安信得利生物工程有限公司）；風(fēng)味酶、中性蛋白酶購于襄陽新葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（24萬U/g 50 g）、木瓜蛋白酶（60萬U/g 20 g）、復(fù)配蛋白酶購于南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；胃蛋白酶（1∶3000）、胰蛋白酶（1∶250）、凝血酶（1 000 units/0.85 mg solid）購于北京索萊寶科技有限公司；纖維蛋白原、凝血酶購于索萊寶生物科技有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液、瓊脂粉購于天津索羅門生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 酶解水蛭地龍混合藥渣 本實驗采用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)配蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶解水蛭地龍混合藥渣，分別在廠家給出的最佳工藝條件下進(jìn)行。

2.1.1 樣品制備方法 稱取5 g藥渣，加入不同種類蛋白酶，于70 mL生理鹽水中混合均勻，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中進(jìn)行反應(yīng)，實驗條件見表1。其中，酶底比為反應(yīng)過程中酶的質(zhì)量用量與藥渣的質(zhì)量之比。待反應(yīng)結(jié)束，離心，取上清液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 酶種類篩選實驗條件Tab.1 Experimental conditions for screening enzyme species

對每種酶設(shè)置藥渣對照組（藥渣+生理鹽水）及酶對照組（酶+生理鹽水），反應(yīng)條件分別與樣品組保持一致。設(shè)置藥渣對照組以消除藥渣自身含有的抗凝活性成分對酶解效果的影響，設(shè)置蛋白酶對照組以消除蛋白酶對抗凝活性測試的影響。

2.2 水解產(chǎn)物體外抗凝活性對比

2.2.1 凝血酶滴定法 0.5%纖維蛋白原溶液的配制：精密稱取0.015 g纖維蛋白原，加入3 mL PBS緩沖液，37℃水浴溶解。現(xiàn)用現(xiàn)配。

凝血酶溶液的配制：以PBS緩沖液為溶劑，將1 000 U/0.85 mg凝血酶溶解并定容至100 mL，配制成濃度為10 U/mL凝血酶溶液。4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

參照 2015版《中國藥典》操作方法[7]，取 100 μL 2.1.1項下制備的各溶液，加入200 μL 0.5%纖維蛋白原溶液，37℃溫育2 min。每隔4 min滴加2 μL 10 U/mL凝血酶溶液，直至凝固，以倒立時無液滴流下為標(biāo)準(zhǔn)。記錄滴加次數(shù)。滴加次數(shù)越多，說明使溶液凝固所需的凝血酶越多，即溶液的抗凝效果越好。

2.2.2 纖維蛋白原平板溶圈法 2.5%瓊脂溶液的配制：稱取0.825 g瓊脂粉，加入33 mL PBS緩沖液，電熱套加熱至溶液澄清透明，即為溶解。

將纖維蛋白原平板法[8]稍加改進(jìn)，采用雙層板結(jié)構(gòu)。取經(jīng)消毒的φ15 cm培養(yǎng)皿，趁熱加入33 mL 2.5%瓊脂溶液作為下層板，靜置10 min，待其凝固。配制36 mL 0.5%纖維蛋白原溶液（方法參照2.2.1項下），取10 U/ml凝血酶溶液4 mL，溫育至37℃，隨后加入到纖維蛋白原溶液中，快速混勻，倒入培養(yǎng)皿中作為上層板，靜置30 min，待其凝固成板。將0.9%氯化鈉溶液、各酶酶解液及其平行對照溶液取5 μL進(jìn)行點樣，間距大于2 cm，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃溫育6 h，記錄直徑大小并計算纖溶面積。其中，△S表示每個樣品組的面積減去對應(yīng)酶對照組和藥渣對照組的面積。纖溶面積越大，說明溶解的纖維蛋白原越多，即溶液的抗凝效果越好。見表2。

表2 不同酶水解水蛭地龍混合藥渣產(chǎn)物抗凝活性對比Tab.2 Comparison of anticoagulant activity of hirudo and pheretima residue hydrolyzed by different enzymes

2.3 結(jié)果 通過表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行8次凝血酶滴定后產(chǎn)生凝固現(xiàn)象，而溶圈法中沒有溶圈出現(xiàn)，在結(jié)果分析過程中需要將兩種抗凝實驗的結(jié)果綜合進(jìn)行分析。同時，以0.9%氯化鈉溶液的實驗結(jié)果為參照，采用凝血酶滴定法8次以內(nèi)出現(xiàn)凝固現(xiàn)象的視為無抗凝活性。

在弱酸性環(huán)境中，采用酸性蛋白酶、風(fēng)味酶和中性蛋白酶對混合藥渣進(jìn)行酶解后，凝血酶滴定法顯示兩種酶解液均未發(fā)生凝固，而藥渣對照組和酶對照組分別在12次左右和8次后發(fā)生凝固。結(jié)合溶圈法的△S值分析，可以發(fā)現(xiàn)，纖溶面積由小到大依次為：酸性蛋白酶<風(fēng)味酶<中性蛋白酶，即進(jìn)行酶解后混合藥渣溶液中含有抗凝活性成分，且中性蛋白酶的酶解效果更好。

在堿性環(huán)境中，采用木瓜蛋白酶、復(fù)配蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對混合藥渣進(jìn)行酶解。結(jié)合凝血酶滴定法和溶圈法分析可發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解后，溶液的抗凝活性沒有明顯提高，酶解效果較差。復(fù)配蛋白酶和堿性蛋白酶的滴定次數(shù)和纖溶面積都遠(yuǎn)大于藥渣對照組和蛋白酶對照組，這說明酶解液比藥渣和酶對照組表現(xiàn)出更強的抗凝活性。

綜合以上數(shù)據(jù)分析，將△S值進(jìn)行對比可以發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解的效果最好。在堿性環(huán)境中蛋白酶對水蛭和地龍混合藥渣的酶解效果遠(yuǎn)好于在酸性環(huán)境中蛋白酶的酶解效果，且堿性越強，酶解液的抗凝活性越強，具體原因尚需要進(jìn)一步研究分析。通過以上實驗可以確定堿性蛋白酶為酶解水蛭地龍混合藥渣最佳酶，并進(jìn)一步考察其酶解水蛭地龍混合藥渣的工藝條件。

2.4 堿性蛋白酶酶解水蛭地龍混合藥渣工藝優(yōu)化 考察工藝條件：溶液pH值、酶底比、酶解時間和酶解溫度，采用纖維蛋白原平板溶圈法評價酶解產(chǎn)物的抗凝活性。

2.4.1 樣品制備方法 稱取5 g藥渣，加入一定量堿性蛋白酶，于70 mL生理鹽水中混合均勻，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中進(jìn)行反應(yīng)，實驗條件見表3。待反應(yīng)結(jié)束，離心，取上清液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 單因素實驗優(yōu)化堿性蛋白酶水解水蛭地龍混合藥渣反應(yīng)條件設(shè)計表Tab.3 Optimization of reaction conditions for hydrolysis of hirudo and pheretima residue by alkaline protease by single factor experiment

設(shè)置藥渣對照組（藥渣+生理鹽水）及酶對照組（酶+生理鹽水），反應(yīng)條件分別與樣品組保持一致。

2.4.2 產(chǎn)物體外抗凝活性對比 采用纖維蛋白原平板溶圈法對酶解產(chǎn)物進(jìn)行抗凝活性評價，以纖溶面積為評價指標(biāo)。纖維蛋白原平板制作方法參照2.2.2。

取5 μL 0.9%氯化鈉溶液、不同梯度條件下的酶解液及其平行對照溶液進(jìn)行點樣，間距大于2 cm，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃溫育6 h，記錄直徑大小，計算纖溶面積。

3 實驗結(jié)果

3.1 溶液pH值 根據(jù)堿性蛋白酶廠家提供的最優(yōu)實驗條件，確定溶液pH值的考察范圍是9.6～12.0，每隔0.6設(shè)置一個梯度。在酶底比0.75%、酶解時間4 h、酶解溫度45℃的條件下，考察pH值對酶解液抗凝活性的影響，樣品液、酶對照組和藥渣對照組的纖溶面積如圖1所示。從圖中可以看出，隨著pH值的增大，樣品組和酶對照組的纖溶面積呈現(xiàn)先降低后升高的過程。而藥渣對照組的纖溶面積隨著pH值的增大而逐步減小。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的升高，△S值出現(xiàn)先升高再降低的趨勢。當(dāng)pH值為11.4時，△S值最大為1.60 cm2，即堿性蛋白酶酶解水蛭地龍混合藥渣的最佳pH值為11.4。

圖1 不同pH值下各溶液的纖溶面積Fig.1 The fibrinolysis area of each solution at different pH values

3.2 酶底比 在pH值11.4、酶解時間4 h、酶解溫度45℃的條件下，考察酶底比對酶解纖溶面積液抗凝活性的影響。從圖2中可以看出，酶解液和酶對照組的纖溶面積隨著酶底比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)酶底比為0.95%時，纖溶面積達(dá)到最大，即溶液的抗凝活性最強。因此，選擇0.95%最為最佳的酶底比。

圖2 不同酶底比下各溶液的纖溶面積Fig.2 The fibrinolysis area of each solution under different enzyme substrate ratio

3.3 酶解時間 在pH值11.4、酶底比0.95%、酶解溫度45℃的條件下，考察酶解時間對酶解液抗凝活性的影響。結(jié)果見圖3。隨著酶解時間的延長，酶對照組和藥渣對照組的纖溶面積變化不大；而樣品組的纖溶面積出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢，但變化范圍不大。這說明酶解時間對反應(yīng)液抗凝活性的影響較小。當(dāng)酶解時間為4 h時，酶解液的纖溶面積最大，對應(yīng)的△S值也最大，如表4所示。因此確定4 h為最佳酶解時間。

表4 不同酶解時間下的△S值Tab.4 The△S value under different enzymolysis time

圖3 不同酶解時間下各溶液的纖溶面積Fig.3 The fibrinolysis area of each solution under different enzymolysis time

3.4 酶解溫度 在pH值11.4、酶底比0.95%、酶解時間4 h的條件下，考察酶解溫度對酶解液抗凝活性的影響。從圖4中可以看出，隨著酶解溫度的變化，樣品組的纖溶面積出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但整體的變化范圍不大；藥渣對照組的纖溶面積基本沒有變化，也就是說溫度對藥渣的影響不大；酶對照組的纖溶面積出現(xiàn)逐漸降低的趨勢。各酶解溫度下的△S值列于表5。從表中可以看出，酶解溫度從40℃升高到43℃后，△S值明顯增加；此后，隨著溫度的進(jìn)一步上升，△S值的升高趨于緩和。當(dāng)酶解溫度為45℃時，△S值達(dá)到最大，即抗凝活性最強。因此確定45℃為最佳酶解溫度。

圖4 不同酶解溫度下各溶液的纖溶面積Fig.4 The fibrinolysis area of each solution at different enzymolysis temperature

表5 不同酶解溫度下的△S值Tab.5 The△S values at different enzymolysis temperatures

4 討論與結(jié)論

4.1 不同種類蛋白酶對水解液抗凝活性影響的原因分析 采用不同的蛋白酶對其進(jìn)行酶解，主要的不同之處在于溶液的pH值。隨著溶液pH值的增加，混合藥渣酶解液的抗凝效果逐漸增強。在強酸溶液中進(jìn)行酶解時，酶解液和藥渣對照組均出現(xiàn)了白色絮狀沉淀。究其原因，可能是由于水蛭地龍混合藥渣在強酸性環(huán)境中發(fā)生反應(yīng)，生成的物質(zhì)導(dǎo)致纖維蛋白原溶解性降低從而析出，或者生成的物質(zhì)與纖維蛋白原發(fā)生反應(yīng)。具體原因待進(jìn)一步研究和分析。

4.2 堿性蛋白酶酶解混合藥渣工藝條件考察 采用單因素法考察堿性蛋白酶對混合藥渣酶解的工藝條件，得到抗凝活性最強的工藝條件為：酶底比0.95%、pH 11.4、酶解溫度45℃、酶解時間4 h。在考察過程中發(fā)現(xiàn)，酶解液的抗凝活性隨著溶液pH值和酶底比的改變而有較大的變化，而隨著酶解時間和酶解溫度的變化改變較小。這說明，4個酶解條件中溶液的pH值和酶底比對酶解液的抗凝活性影響最大。

4.3 水蛭地龍混合藥渣的再利用展望 水蛭地龍混合藥渣中主要含有大量蛋白質(zhì)、少量多糖和淀粉等營養(yǎng)成分，以及多種氨基酸和微量元素等。除了采用酶解的方法得到抗凝活性物質(zhì)外，還可針對不同的物質(zhì)設(shè)計不同的再利用方式，提高藥渣廢棄物的再利用效率，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的同時，實現(xiàn)資源的節(jié)約利用和環(huán)境的保護(hù)。