小分子級(jí)聯(lián)自組裝/解組裝策略在精準(zhǔn)癌癥診療中的應(yīng)用

賈德英，李爽爽，鄭 珍

（天津醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，天津 300070）

在癌癥的診斷與治療中，“智能”識(shí)別及靶向癌細(xì)胞是精確診斷與高效治療的關(guān)鍵。目前常見(jiàn)的兩種靶向遞送成像探針（或化療藥物）的策略包括：①共價(jià)探針前體（或前藥），即將示蹤分子（或抗腫瘤藥物）與響應(yīng)基團(tuán)——如雙硫鍵、糖苷鍵和特異性氨基酸序列等共價(jià)相連形成探針前體（或前藥），遞送至腫瘤區(qū)域后，靶標(biāo)生物分子與響應(yīng)基團(tuán)作用點(diǎn)亮探針（或釋放藥物）［1］；②納米載藥體系，即將示蹤分子（或抗腫瘤藥物）負(fù)載于納米組裝體中，在腫瘤環(huán)境中響應(yīng)性點(diǎn)亮探針（或釋放藥物）［2］。兩種方法均表現(xiàn)出一定的腫瘤靶向成像（或治療）效果，但仍然存在較大的局限性。小分子共價(jià)前體探針（或藥物）存在的局限包括機(jī)體代謝速度快以及對(duì)其他器官毒副作用大。而納米載藥體系中的納米顆粒盡管對(duì)腫瘤組織表現(xiàn)出增強(qiáng)的滲透性和滯留效應(yīng)（Enhanced permeability and retention effect，EPR）［3］，但腫瘤穿透能力仍然有限。此外，各類(lèi)納米載藥體系還存在分子結(jié)構(gòu)與分子量不明確、批次重現(xiàn)性差、易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲等問(wèn)題［4］。

為克服上述局限，小分子智能“原位自組裝”策略應(yīng)運(yùn)而生。該策略借助于腫瘤組織特異性表達(dá)的生物標(biāo)志物，在腫瘤部位原位誘導(dǎo)示蹤分子（或藥物）衍生物自組裝，從而原位形成納米探針（或納米藥物），可獲得更好的顯像及腫瘤抑制效果［5］。該策略兼具小分子體系和納米體系遞送的優(yōu)點(diǎn)，利用小分子作為前體提高了示蹤分子（或藥物分子）在腫瘤組織的生物穿透性，而自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)則提供了更好的生物利用度、更高的代謝穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的滯留時(shí)間。在生物成像應(yīng)用中，自組裝過(guò)程中小分子到超分子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，能夠?qū)崿F(xiàn)特定成像信號(hào)的放大和對(duì)比度的增強(qiáng)，有效提高分析檢測(cè)靈敏度；此外，納米探針在瘤內(nèi)的滯留還可以增加成像時(shí)間窗口［6－7］。在藥物遞送應(yīng)用中，腫瘤原位自組裝形成的納米藥物具有組裝誘導(dǎo)滯留效應(yīng)（Assembly induced retention，AIR）［8］，可以顯著增強(qiáng)藥物在瘤內(nèi)的滯留時(shí)間，同時(shí)納米藥物進(jìn)一步緩慢釋放出游離的小分子抗癌藥物，實(shí)現(xiàn)靶向富集和藥物緩釋的雙重功效［9－11］。迄今為止，該策略已被成功運(yùn)用于精確制造具有增強(qiáng)成像信號(hào)和提高腫瘤治療效果的納米材料。

基于個(gè)性化診療和高靈敏診斷的臨床需求，設(shè)計(jì)在病灶部位響應(yīng)性應(yīng)答的“智能型”納米材料，正逐步成為納米醫(yī)用材料的發(fā)展趨勢(shì)。然而，生物體內(nèi)的自組裝行為是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，如何通過(guò)設(shè)計(jì)分子單元并利用生物環(huán)境精準(zhǔn)調(diào)控其在體內(nèi)的組裝進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)自組裝納米材料的活體功能十分具有挑戰(zhàn)。近年來(lái)，為進(jìn)一步提升對(duì)活體自組裝體系的控制，研究者們開(kāi)發(fā)了“級(jí)聯(lián)自組裝”策略。相比于單一的生物分子或化學(xué)反應(yīng)調(diào)控的自組裝，具有級(jí)聯(lián)自組裝能力的分子可以和多個(gè)響應(yīng)分子作用，并實(shí)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，因此在癌癥診斷和治療中表現(xiàn)出更強(qiáng)的靶向性、更精確的時(shí)空控制度和增強(qiáng)的生物效應(yīng)。此外，設(shè)計(jì)可控的級(jí)聯(lián)自組裝/解組裝策略同樣具有重要意義。小分子的組裝和其后的納米結(jié)構(gòu)解組裝可分別轉(zhuǎn)換為成像信號(hào)的“Off”到“On”，實(shí)現(xiàn)兩種靶標(biāo)分子的檢測(cè)及更高靈敏度的“Turn on”。目前，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)可“智能”區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞、以及癌細(xì)胞細(xì)胞器精準(zhǔn)靶向的級(jí)聯(lián)增強(qiáng)型自組裝/解組裝體系，實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的組裝調(diào)控與診療分子遞送，仍處在探索階段。基于此現(xiàn)狀，本文總結(jié)了現(xiàn)有的小分子增強(qiáng)型級(jí)聯(lián)自組裝、級(jí)聯(lián)自組裝/解組裝體系及其在癌癥診療中的應(yīng)用，以期為實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)高效的診療分子遞送、藥用功能提升提供新思路。

1 增強(qiáng)型級(jí)聯(lián)自組裝

增強(qiáng)型級(jí)聯(lián)自組裝的基本原理為：通過(guò)設(shè)計(jì)腫瘤微環(huán)境刺激響應(yīng)的關(guān)鍵化學(xué)基團(tuán)，前體分子首先在腫瘤部位發(fā)生一級(jí)自組裝形成初級(jí)納米結(jié)構(gòu)，加速在腫瘤部位的富集與特定癌細(xì)胞的攝取，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的有效區(qū)分；該初級(jí)納米結(jié)構(gòu)在進(jìn)入癌細(xì)胞后可進(jìn)一步通過(guò)與胞內(nèi)特定生物分子相互作用，誘導(dǎo)二級(jí)自組裝聚集形成增強(qiáng)型納米結(jié)構(gòu)，從而有效提升腫瘤靶向與滯留效果。該級(jí)聯(lián)自組裝的設(shè)計(jì)在癌癥的診療中具有諸多優(yōu)勢(shì)，多分子響應(yīng)的設(shè)計(jì)可以增強(qiáng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)級(jí)聯(lián)自組裝產(chǎn)生的信號(hào)激活和擴(kuò)增也提供了一種高靈敏度的成像策略。

2016年，梁高林課題組［12］通過(guò)將生物大分子和點(diǎn)擊反應(yīng)分別作為觸發(fā)物，首次實(shí)現(xiàn)了可區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的一、二級(jí)級(jí)聯(lián)自組裝，并通過(guò)高分辨冷凍電鏡成像進(jìn)行了分析驗(yàn)證。如圖1A所示，在特定腫瘤細(xì)胞外部環(huán)境中，前體分子Cys（SEt）－Glu－Tyr（H2PO3）－Phe－Phe－Gly－CBT（1）的磷酸根被腫瘤細(xì)胞外大量分泌的堿性磷酸酯酶（Alkaline phosphatase，ALP）切除，引發(fā)第一級(jí)自組裝形成由線性分子（2）堆積的平面納米纖維（Nanofiber 2）。而當(dāng)這些小分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，小分子上的雙硫鍵被谷胱甘肽（Glutathione，GSH）還原，露出半胱氨酸上的氨基硫醇結(jié)構(gòu)，裸露的氨基硫醇結(jié)構(gòu)可與小分子結(jié)構(gòu)中的氰基苯并噻唑發(fā)生高效的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)，生成環(huán)狀的二聚體（2－D）。由于二聚體中苯并噻唑提供的強(qiáng)π－π堆積作用，該二聚體分子之間會(huì)相互吸引，引發(fā)第二級(jí)自組裝形成由環(huán)狀單體堆積的管狀納米纖維（Nanofiber 2－D）。冷凍電鏡技術(shù)能夠在保持生物樣品接近生理狀態(tài)的前提下提供精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，為觀察生物樣品中的自組裝納米結(jié)構(gòu)提供技術(shù)支持。因此，作者通過(guò)高分辨冷凍電鏡成像分析揭示了這兩種不同納米纖維在形貌及尺度上的微觀差異。該分子“一石二鳥(niǎo)”的設(shè)計(jì)提供了一種智能超分子納米結(jié)構(gòu)活體調(diào)控的方法，有望在提高分子遞送精準(zhǔn)度、提升藥用效能等方面有所突破。

圖1 小分子級(jí)聯(lián)自組裝實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的特異性成像和靶向遞送Fig.1 Cascade self-assembly of small molecules for specific imaging and targeted delivery

其后，南開(kāi)大學(xué)的楊志謀課題組［13］開(kāi)發(fā)了依賴(lài)肝癌細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境不同而觸發(fā)的級(jí)聯(lián)自組裝體系，在肝癌診斷與治療中具有重要意義。相比于正常細(xì)胞，肝癌細(xì)胞不僅胞外高表達(dá)ALP，同時(shí)胞內(nèi)有更高濃度的GSH。基于此，研究人員構(gòu)建了可在這兩種刺激下發(fā)生逐步組裝的前體分子NBD－GFFYp-ss-ERGD（3），3在胞外ALP的催化下發(fā)生酶促反應(yīng)，誘發(fā)一級(jí)自組裝形成納米粒子。由于3含有能與癌細(xì)胞膜表面高表達(dá)的整合素αvβ3結(jié)合的靶向序列RGD，形成的納米粒子可通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并與胞內(nèi)GSH發(fā)生還原反應(yīng)誘發(fā)二級(jí)自組裝，轉(zhuǎn)化成納米纖維。這種級(jí)聯(lián)自組裝現(xiàn)象在HepG2和QGY7703兩種肝癌細(xì)胞中均能觀察到，而在其他癌細(xì)胞或正常肝細(xì)胞中則無(wú)法觀察到（圖1B），因此可以實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的特異性成像及靶向遞送。此外，在細(xì)胞內(nèi)形成的納米纖維被證實(shí)可以進(jìn)一步誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，或可為癌細(xì)胞的消除提供新思路。在此基礎(chǔ)上，Yang等［14］又設(shè)計(jì)了一種靶向肺癌細(xì)胞的級(jí)聯(lián)自組裝體系，首次將級(jí)聯(lián)組裝的調(diào)控策略運(yùn)用到了活體。在肺癌細(xì)胞外環(huán)境中，ALP將前體分子NBD－GFFYpG－N=N－ERGD轉(zhuǎn)化為NBD－GFFYG－N=N－ERGD，誘發(fā)納米顆粒或短納米纖維的形成。這些納米顆粒或短纖維可通過(guò)內(nèi)吞作用被肺癌細(xì)胞有效吸收，同時(shí)分子中偶氮基團(tuán)的存在有利于納米結(jié)構(gòu)的溶酶體逃逸和線粒體積累。線粒體聚集后，線粒體膜上的還原酶可將NBD－GFFYG－N=N－ERGD進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為組裝能力更強(qiáng)的分子NBD－GFFYG－aniline，在線粒體中發(fā)生二級(jí)自組裝。二級(jí)組裝形成的納米纖維將導(dǎo)致線粒體膜破裂，釋放細(xì)胞色素C，并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。ROS最終可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded protein response，UPR）［15］，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞選擇性死亡。

通過(guò)類(lèi)似的策略，中國(guó)藥科大學(xué)鐘文英團(tuán)隊(duì)［16］設(shè)計(jì)了一種具有三酶響應(yīng)性的自組裝多肽分子LNDGFFYP－ES（LND－1p－ES），可用于成像分子及藥物的無(wú)載體靶向遞送。該分子的主要組成部分有：①藥物氯尼達(dá)明（Lonidamine，LND），作為疏水頭基發(fā)揮藥效的同時(shí)增強(qiáng)多肽的自組裝能力；②Gly－Phe－Phe－Tyr，作為組裝序列提供自組裝的驅(qū)動(dòng)力；③磷酸化的酪氨酸，作為ALP響應(yīng)基團(tuán)；④琥珀酸單酯，作為酯酶（Carboxylesterase，CES）響應(yīng)基團(tuán)。細(xì)胞膜表面的ALP首先催化LND－1p－ES轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)ND－1－ES，觸發(fā)初級(jí)自組裝。其后，LND－1p－ES/LND－1－ES進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在胞內(nèi)ALP和CES共同作用下轉(zhuǎn)化為凝膠因子LND－1－OH。后者可在細(xì)胞內(nèi)形成致密的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，不僅能干擾肌動(dòng)蛋白的組裝、提高癌細(xì)胞的ROS水平，還可作為藥物儲(chǔ)庫(kù)，在胞內(nèi)蛋白酶的作用下緩慢釋放LND，通過(guò)破壞線粒體功能誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。由于ALP位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，而CES主要位于細(xì)胞質(zhì)，因此癌細(xì)胞高表達(dá)的ALP和CES可對(duì)LND－1p－ES的細(xì)胞內(nèi)外的自組裝進(jìn)行時(shí)空調(diào)控，進(jìn)一步提升自組裝的時(shí)空精準(zhǔn)度。如圖1C中的體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)顯示，LND－1p－ES在ALP和CES作用具有較高的穩(wěn)定性，而在ALP、CES和蛋白酶K共同作用下，小鼠體內(nèi)的熒光信號(hào)迅速減弱，成功實(shí)現(xiàn)了三酶共響應(yīng)的成像與釋放。

在體內(nèi)級(jí)聯(lián)組裝的策略開(kāi)發(fā)中，王浩課題組［17］通過(guò)設(shè)計(jì)系列工作，實(shí)現(xiàn)了組裝體的形貌調(diào)控。其基本原理為連接抗癌藥物的納米粒子在腫瘤部位首先組裝形成初級(jí)納米纖維，起到“晶種”的作用以促進(jìn)納米粒子的形態(tài)轉(zhuǎn)變，使納米纖維的增長(zhǎng)速度明顯加快，從而實(shí)現(xiàn)抗癌藥物在腫瘤部位的加速積累（圖2）。該課題組設(shè)計(jì)了一種可形變的納米材料活體BP－KLVFFK－GGDGR－YIGSR（4）來(lái)構(gòu)筑人工細(xì)胞外基質(zhì)（Artificial extracellular matrix，AECM），用于抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［18］。由于雙芘（Bis-pyrene，BP）分子間的疏水相互作用，分子4首先通過(guò)快速沉淀法形成納米顆粒（4－NPs）。靜脈注射后，由于腫瘤部位的EPR效應(yīng)，4－NPs有效地積聚在腫瘤部位。累積的4－NPs同時(shí)在實(shí)體腫瘤周?chē)D(zhuǎn)化為納米纖維（4－NFs），并進(jìn)一步纏繞與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合形成AECM。AECM在原發(fā)腫瘤部位穩(wěn)定存在72 h以上，有效抑制了乳腺癌和黑色素瘤模型的肺轉(zhuǎn)移。在其后的工作中，王浩等［19］通過(guò)金屬離子調(diào)控多肽的自組裝過(guò)程，設(shè)計(jì)了可用于腫瘤成像和治療的分子BP－KLVFF－RGD（BKR）。當(dāng)Ca2+存在時(shí)，組裝好的納米顆粒可原位轉(zhuǎn)化為納米纖維。BKR通過(guò)在U87細(xì)胞表面與Ca2+結(jié)合發(fā)生點(diǎn)亮，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性成像。此外，BKR肽在細(xì)胞表面的仿生形態(tài)轉(zhuǎn)化可特異性殺死癌細(xì)胞，顯示了該分子在癌癥診療中的巨大潛力。在靶向癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，Wang等［20］進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞器靶向的級(jí)聯(lián)自組裝多肽。該多肽在腫瘤組織中首先組裝成納米顆粒，然后進(jìn)入癌細(xì)胞并在線粒體靶向細(xì)胞肽KLAK的幫助下到達(dá)線粒體。由于癌細(xì)胞的線粒體周?chē)写罅縍OS生成，ROS破壞納米顆粒的親水/疏水平衡使其向納米纖維轉(zhuǎn)化，在形態(tài)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，治療性肽可以通過(guò)多位點(diǎn)與線粒體膜發(fā)生相互作用，極大地增強(qiáng)對(duì)線粒體膜的破壞作用，從而有效提升腫瘤治療效果。該系列級(jí)聯(lián)組裝策略為疾病的診斷和治療提供了新策略。

圖2 重組裝形態(tài)轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)抗癌藥物在腫瘤部位的加速積累［17］Fig.2 Self-assembly induced morphological transformation accelerate the accumulation of anticancer drugs in tumor sites［17］

雖然響應(yīng)多種外部刺激的多肽設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但由短肽和非肽小分子共同組裝形成多重響應(yīng)體系的構(gòu)建仍具有挑戰(zhàn)。近日，吉維等［21］通過(guò)多樣化的聯(lián)吡啶衍生物與N-端修飾有官能團(tuán)的二苯丙氨酸二肽（FF，淀粉樣蛋白的核心識(shí)別序列和最簡(jiǎn)單的多肽砌塊）衍生物（ZFF，F(xiàn)mocFF）多級(jí)次共組裝，實(shí)現(xiàn)了多重響應(yīng)的超分子自組裝。FF二肽與聯(lián)吡啶衍生物之間的共組裝動(dòng)力來(lái)自羧酸和吡啶之間較強(qiáng)的分子間氫鍵，通過(guò)對(duì)聯(lián)吡啶/二肽組分的微調(diào)，可有效控制其形態(tài)多樣性，從而獲得納米纖維、納米帶、納米棒、納米球、納米管等多種形貌的組裝體，以實(shí)現(xiàn)其生物功能的調(diào)控。該系列工作將促進(jìn)級(jí)聯(lián)自組裝體系的合理設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

2 級(jí)聯(lián)自組裝/解組裝

小分子探針自組裝成超分子結(jié)構(gòu)往往會(huì)導(dǎo)致探針的熒光自猝滅或19F核磁共振信號(hào)的關(guān)閉，此時(shí)通過(guò)蛋白酶等靶分子作用可破壞超分子結(jié)構(gòu)生成單體分子，實(shí)現(xiàn)熒光或19F核磁共振信號(hào)的打開(kāi)。基于該級(jí)聯(lián)自組裝/解組裝策略，研究者們開(kāi)發(fā)了一系列高靈敏度的光、磁癌癥診療納米探針。“智能”組裝/解組裝策略在藥物遞送中的應(yīng)用已有所總結(jié)［22］，故在本綜述中不再贅述。

2.1 光學(xué)成像

不同于常規(guī)熒光探針的聚集誘導(dǎo)猝滅現(xiàn)象，梁高林教授課題組［23］利用2-氰基-6-氨基苯并噻唑與半胱氨酸（CBT－Cys）點(diǎn)擊縮合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了自組裝誘導(dǎo)的熒光增強(qiáng)。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種熒光探針Cys（StBu）－Lys（FITC）－Asp－Glu－Val－Asp－CBT，通過(guò)GSH控制在細(xì)胞內(nèi)自組裝成FITC－納米顆粒（FITC－NPs）。巧妙的是，當(dāng)這種多功能熒光探針經(jīng)過(guò)GSH控制的縮合形成FITC－NPs時(shí)，熒光并未發(fā)生自猝滅，反而表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光信號(hào)。隨后的Caspase-3對(duì)FITC－NPs切割導(dǎo)致其分解，此時(shí)熒光發(fā)生去猝滅而產(chǎn)生第二次熒光增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中GSH和Caspase-3的熒光“On－On”檢測(cè)。

相比于上述“始終打開(kāi)”的熒光探針設(shè)計(jì)，熒光“關(guān)閉－打開(kāi)”探針的背景噪聲更低，因此也具有更高的檢測(cè)靈敏度［24］。當(dāng)探針在目標(biāo)部位“打開(kāi)”熒光之前，背景信號(hào)需要被關(guān)閉。目前常用的兩種猝滅策略為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）［25］和聚集誘導(dǎo)猝滅（Aggregation induced quenching，ACQ）［26］策略。與單重猝滅探針相比，雙重猝滅探針可進(jìn)一步減少背景信號(hào)強(qiáng)度，因此其“打開(kāi)”的熒光信號(hào)的放大倍數(shù)會(huì)更大。基于此，梁高林教授課題組［27］設(shè)計(jì)了一種可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)FRET和ACQ兩種猝滅策略的小分子前體熒光探針Cys（St Bu）－Lys（Gly－Lys（DABCYL）－Gly－Gly－Arg－Arg－Val－Arg－Gly－FITC）－CBT（5）。探針5進(jìn)入癌細(xì)胞后，發(fā)生還原控制的縮合反應(yīng)，“智能”地自組裝成雙重猝滅的納米顆粒5-NPs。在細(xì)胞內(nèi)弗林蛋白酶的剪切下，游離的FITCGRVRR將從納米顆粒上脫離，完全解除其雙重猝滅，從而達(dá)到具有高信噪比的熒光信號(hào)“打開(kāi)”。通過(guò)用其他酶特異性剪切的底物取代RVRR底物，該設(shè)計(jì)亦可實(shí)現(xiàn)其他生物分子的局部靈敏檢測(cè)或成像。

除了上述“On－On”和“Off－On”模式外，Zhang等［28］通過(guò)熒光信號(hào)的連續(xù)多次開(kāi)關(guān)實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中納米纖維的級(jí)聯(lián)組裝－解組裝過(guò)程的追蹤。其設(shè)計(jì)的前體探針（2-Pyridinyldithio）－ethoxy－glutaric acyl－Phe－Phe－Lys（4-nitro-2，1，3-benzoxadiazole）－Tyr（H2PO3）－OH（PEA－NBD－Yp）由3部分組成：①ALP響應(yīng)序列Phe－Phe－Lys－Tyr（H2PO3）－OH；②2-硫吡啶封住的自斷裂結(jié)構(gòu)巰基乙醇，可通過(guò)二硫鍵響應(yīng)GSH還原誘導(dǎo)解組裝；③環(huán)境敏感型的熒光團(tuán)4-硝基-2，1，3-苯并噁二唑（NBD）。探針PEANBD－Yp單體處于熒光Off 1狀態(tài)，在特定癌細(xì)胞的胞外環(huán)境中，探針PEA－NBD－Yp首先被ALP轉(zhuǎn)化成PEA－NBD－Y，并在細(xì)胞外膜上自組裝成納米纖維，伴隨細(xì)胞膜上熒光信號(hào)“開(kāi)啟”（On 1）。其后，自組裝的納米纖維被細(xì)胞攝取，伴隨細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)“開(kāi)啟”（On 2）。最后，細(xì)胞內(nèi)納米纖維中的PEA－NBD－Y單體將被胞內(nèi)GSH還原，生成NBD－Y，使納米纖維解組裝并伴隨熒光信號(hào)“關(guān)閉”（Off 2）。該工作通過(guò)連續(xù)的熒光信號(hào)“開(kāi)啟”和“關(guān)閉”，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中納米纖維的級(jí)聯(lián)自組裝-解組裝過(guò)程示蹤，也為研究者深入了解活細(xì)胞中的生物過(guò)程（如微管蛋白的形成）提供了一種新思路。

袁月等進(jìn)一步拓展了“組裝/解組裝”策略，實(shí)現(xiàn)了D-螢光素的胞內(nèi)合成與長(zhǎng)效釋放。D-螢光素半衰期短（小于30 min）是應(yīng)用螢火蟲(chóng)生物發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行活體成像的最大挑戰(zhàn)。以腦膠質(zhì)瘤的重要標(biāo)志物脂肪酸酰胺水解酶（Fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）作為腫瘤特異性靶標(biāo)，Yuan等［7］設(shè)計(jì)了潛在生物發(fā)光（Bioluminescence，BL）探針（D－Cys－Lys－CBT）2（6），6在進(jìn)入細(xì)胞后，雙硫鍵被細(xì)胞內(nèi)的GSH還原，自組裝形成納米粒子6-NPs。由于6-NPs的疏水性和納米尺寸不易被細(xì)胞泵出，因此其在細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)時(shí)間有效延長(zhǎng)。其后，通過(guò)FAAH裂解6-NPs中環(huán)狀二聚體的酰胺鍵，納米粒子被緩慢分解，釋放出Lys-氨基-D-螢光素或氨基-D-螢光素，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)數(shù)日的生物發(fā)光成像。因此，該D-螢光素衍生物可用于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)腫瘤模型中FAAH的活性或各種生物事件的長(zhǎng)期生物發(fā)光成像。在此基礎(chǔ)上，該課題組又設(shè)計(jì)了兩種化學(xué)穩(wěn)定的螢光素前體分子CBT－D－Cystine－CBT（D－1）和CBT－LCystine－CBT（L－1），可在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)自組裝/解組裝的方式釋放D-氨基螢光素用于生物發(fā)光成像［29］。基于其良好的穩(wěn)定性，該系列前體分子有望作為D-螢光素的替代品廣泛應(yīng)用于生物發(fā)光成像。

2.2 磁共振成像

磁共振成像（MRI）因其顯著的軟組織對(duì)比度、優(yōu)異的成像分辨率和無(wú)電離輻射等優(yōu)點(diǎn)而成為使用最頻繁的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)之一。由于水分子中固有的1H信號(hào)，使得傳統(tǒng)1H MRI的成像信號(hào)受到的背景干擾嚴(yán)重。相對(duì)而言，19F MRI具有與1H MRI相似的靈敏度，并且內(nèi)源濃度通常低于檢出限，極低的背景信號(hào)讓19F外源造影劑具有極高的信噪比和特異性，因而在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。借助19F NMR/MRI技術(shù)，很多含氟化合物被用于評(píng)估生物標(biāo)記物和生命過(guò)程。然而，19F成像通常需使用高劑量的探針使目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)生高信號(hào)。因此，開(kāi)發(fā)低注射劑量和高局部信號(hào)的19F磁共振探針十分必要。

如圖3A所示，袁月等［30］報(bào)道了一種小分子在體內(nèi)自發(fā)組裝-目標(biāo)位置解組裝產(chǎn)生19F NMR/MRI信號(hào)的策略，不但大幅提高了19F NMR/MRI信號(hào)的強(qiáng)度、靈敏度和準(zhǔn)確性，還降低了所需19F探針的注射劑量。該探針Cys（St Bu）－Asp－Glu－Val－Asp－Lys（FMBA）－CBT（7）（圖3B）首先在胞內(nèi)還原性環(huán)境中發(fā)生分子間縮合形成二聚體，二聚體堆積自組裝生成19F納米粒子，導(dǎo)致19F NMR/MRI信號(hào)峰展寬而大幅降低。其后在凋亡細(xì)胞中高表達(dá)的酶Casp3/7的剪切下，納米粒子解組裝，釋放出單體分子，19F NMR/MRI信號(hào)被打開(kāi)。如圖3C所示，19F信號(hào)“關(guān)－開(kāi)”的過(guò)程可依次用于檢測(cè)體內(nèi)的GSH和Casp3/7的活性，并實(shí)現(xiàn)了斑馬魚(yú)斷尾凋亡模型中的Casp3/7成像。在后續(xù)工作中，Yuan等［6］設(shè)計(jì)了一種智能靶向蛋白酶Legumain（Lgmn，大多數(shù)人體實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)［31］）的19F MRI探針（Cys（StBu）－Ala－Ala－Asn－Lys（FMBA）－CBT）（8）。與7的設(shè)計(jì)類(lèi)似，在Lgmn的作用下，組裝好的納米粒子的二聚體被剪切斷開(kāi)，解組裝釋放游離單體，19F NMR信號(hào)峰得以重新恢復(fù)。自組裝/解組裝過(guò)程中核磁共振信號(hào)的“On－Off－On”可用于相繼檢測(cè)GSH的濃度和Lgmn的活性。利用該“智能組裝/解組裝”策略，研究人員實(shí)現(xiàn)了斑馬魚(yú)體內(nèi)Lgmn19F核磁共振成像，顯示該策略在腫瘤高靈敏度19F磁共振成像上有著較大的應(yīng)用前景。

圖3 級(jí)聯(lián)組裝/解組裝應(yīng)用于斑馬魚(yú)斷尾凋亡成像［30］Fig.3 Tandem self-assembly and disassembly strategy successfully applied for MR imaging of apoptotic cells in zebrafish［30］

在上述工作基礎(chǔ)上，Liang等［32］結(jié)合1H MRI的高靈敏度和19F MRI的高選擇性?xún)?yōu)點(diǎn)設(shè)計(jì)了雙功能氟探針（TFMB）－Arg－Val－Arg－Arg－Cys（StBu）－Lys－CBT（9）。通過(guò)9進(jìn)一步將Fe3O4納米顆粒（IONP）功能化，得到IONP@9，IONP@9的19F MRI信號(hào)最初由于順磁弛豫增強(qiáng)（Paramagnetic relaxation enhancement，PRE）而關(guān)閉［33］。在弗林蛋白酶的剪切下，（TFMB）－Arg－Val－Arg－Arg從IONP@9復(fù)合物中分離，同時(shí)啟動(dòng)CBT－Cys縮合反應(yīng)，IONP納米顆粒發(fā)生交聯(lián)聚集。一方面，IONP的聚集會(huì)提高周?chē)肿拥臋M向馳豫速率（R2），提高T21H MRI信號(hào)；另一方面，（TFMB）－Arg－Val－Arg－Arg從IONP@9復(fù)合物中分離將減弱PRE效應(yīng)，從而開(kāi)啟19F MRI信號(hào)。該智能分子實(shí)現(xiàn)了14.1 T下斑馬魚(yú)腫瘤的精確雙模（1H和19F）磁共振成像，調(diào)和了傳統(tǒng)MRI探針的選擇性和靈敏度之間的兩難，為實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)成像提供了新思路。

3 展 望

對(duì)癌癥進(jìn)行精確的診斷成像以及提高抗癌藥物的利用率一直是腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。原位調(diào)控納米結(jié)構(gòu)的形成和釋放的策略，既具備了自由藥物分子在腫瘤組織良好的生物穿透性的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又兼具了納米藥物良好的生物利用度和更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間等藥代動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)。在單一生物分子或化學(xué)反應(yīng)調(diào)控自組裝的基礎(chǔ)上，研究者提出了小分子級(jí)聯(lián)自組裝/解組裝策略以進(jìn)一步提高前體分子對(duì)腫瘤組織的靶向性，達(dá)到癌癥精準(zhǔn)成像和抗癌藥的有效富集。在增效的同時(shí)，該策略也實(shí)現(xiàn)了減毒，即可降低藥物在肝腎等器官的非特異性蓄積，從而降低藥物的毒副作用，在癌癥的特異性診療中顯示出巨大潛力。此外，自組裝和重組裝過(guò)程提供了與以往完全不同的癌細(xì)胞殺滅機(jī)理，如克服細(xì)胞多藥耐藥、引起溶酶體增壓、阻斷細(xì)胞物質(zhì)交換等，可為癌癥治療提供新思路。在后續(xù)應(yīng)用研究和臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中，需從提高合成產(chǎn)量、產(chǎn)率，深化活體微環(huán)境分析，優(yōu)化疾病模型和試工業(yè)生產(chǎn)研究等方面繼續(xù)努力。