歐李(Cerasus humilis)內生固氮細菌篩選、鑒定及特性研究

白 潔， 姚 拓*， 雷 楊， 王占軍， 王辛有， 苑力暉

(1.甘肅農業大學草業學院， 甘肅 蘭州 730070； 2.寧夏農林科學院荒漠化治理研究所， 寧夏回族自治區 銀川 750000；3.蘭州植物園， 甘肅 蘭州 730070)

歐李(Cerasushumilis)是一種生長于我國北方荒漠草原、沙地邊緣的矮灌木。具有抗寒、抗旱，再生能力強的特點。由于歐李成叢快、覆蓋率高、根系發達，常被選做生態脆弱區的恢復樹種[1]。王鵬飛等[2]研究發現，栽植歐李對黃土丘陵溝壑區灌下土壤理化性質有不同程度改善。此外，歐李枝葉質地柔軟，含有豐富的鈣、糖和蛋白質等營養物質，是牛羊所喜食的優質飼料[3]。基于此，歐李對緩解生態建設和畜牧業可持續發展之間的矛盾具有重要意義[4]。

歐李經過長期的自然選擇，具有較強的適應性，可在土壤較為貧瘠的條件下正常生長[5]。趙貝貝對歐李樹體礦質營養研究發現，歐李主根與須根系中氮含量最高，高于磷、鉀、鎂、鐵等元素[6]，推測定殖于其根系中的固氮微生物發揮著重要作用。因此從其根系中分離篩選出內生固氮菌的概率較高。定殖于植物根系的內生固氮菌，占據著植物組織內有利于營養供應和微環境穩定的生態位，避免了化合態氮的抑制及土著微生物的競爭，較根外環境更有利于形成高效固氮系統，可充分發揮固氮效能[7-8]。該系統為宿主植物提供氮素來源的同時增加了土壤肥力[9]。方華舟等[10]用含固氮菌的復合菌劑處理稻田土壤后，有效促進了土壤氮、磷、鉀轉換，提高了土壤養分含量。研究發現，內生固氮菌還可通過溶磷、分泌植物生長素(Indole acetic acid,IAA)和鐵載體等改善宿主植物營養吸收，進而促進植物生長并提高產量[11-12]。韓梅等[13]從健康玉米植株中分離純化出2株內生固氮菌，接種后發現對玉米苗期的生長有明顯的促進作用。

目前，國內外學者在農作物、牧草和林木中都已分離獲得內生固氮菌[14-17]，但對于荒漠草原灌木歐李內生固氮菌還缺乏相關報道。本研究對從歐李根系分離獲得的內生固氮菌進行固氮及其他特性研究，篩選出固氮能力較強的菌株，通過16S rDNA基因序列比對確定菌株的分類地位,以期為歐李固氮微生物接種劑的進一步研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料 2021年1月于寧夏回族自治區銀川市永寧縣(38.25° N，106.07° E，海拔1 110 m)挑選生長旺盛的3株3年樹齡歐李植株，距地面約35 cm處，截取其根系，裝入無菌自封袋，放置于冰盒中，運回實驗室4℃冰箱中保存，備用。

1.1.2培養基 無氮(Nitrogen free medium，NFM)培養基[18]用于內生固氮菌的分離及固氮酶活性測定；King氏液體培養基[19]用于內生固氮菌分泌IAA特性測定；無機磷(National botanical research institute’ s phosphate，NBRIP)液體培養基[20]用于內生固氮菌溶無機磷特性測定；蒙金娜有機磷培養基[21]用于內生固氮菌解有機磷特性測定；LB(luria bertani)固體培養基[19]用于內生固氮菌的保存與培養。

上述培養基均在121℃下，滅菌26 min，固體培養基傾倒于9 cm的滅菌培養皿中。

1.2 試驗方法

1.2.1內生固氮菌分離 將3株歐李根系置于水下沖洗干凈表面泥土和其他雜質，移入無菌超凈工作臺，用無菌水沖洗3次，后用無菌濾紙吸干表面水分。進行75%乙醇3 min，2.5%次氯酸鈉7 min，75%乙醇20 min的三步表面消毒。消毒后的植物根系，用無菌水沖洗6次，后用無菌濾紙吸干表面水分，以最后1次無菌水洗滌液涂布于LB固體培養基上，28℃培養24 h，觀察是否有菌長出，以此檢測消毒是否徹底。將3株滅菌根系分別用無菌刀片切成約為1 g的小塊，用高壓滅菌后的研磨棒和研磨缽在9 mL的無菌水中研磨，每株植物根系3次重復。吸取上述織組懸浮液0.1 mL涂布于NFM平板上。接種平板置于28℃恒溫培養箱培養3～7 d。

1.2.2內生固氮菌的初篩 選取NFM培養基中生長較快，菌落形態較大的不同單菌落，進行反復四區劃線[22]，純化后的菌株即為固氮菌。將固氮菌懸浮于20%甘油，保存至—80℃冰箱中備用。

1.2.3內生固氮菌固氮酶活性及促生特性測定 內生固氮菌固酶活性采用乙炔還原法測定[23]；溶磷特性采用鉬銻抗比色法測定[24]；合成植物生長素IAA特性采用Salkowski法測定[25]。

1.2.4優良內生固氮菌株初步鑒定 16S rDNA基因序列擴增：通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[26]。PCR反應體系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL,DNA模板4 μL、引物各1.5 μL和ddH2O 18 μL。PCR反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32個循環；72℃ 5 min。PCR產物由蘭州天啟基因生物科技有限公司測序。將測序結果在Ezbiocloud數據庫中與模式菌株進行同源性比對。選取相似度超過95%的模式菌株相應序列進行系統進化分析，使用MEGA 7.0軟件中ClustalW進行多重比對后，利用鄰近法(Kimura 2-parameter模型；Bootstrap 1000)構建系統發育樹。

1.2.5數據分析 使用Microsoft Excel 2010進行數據整理計算；SPSS 20.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性水平為P<0.05；圖中數據為“平均值±標準誤”并使用Origin 2021作圖；利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 歐李根系內生固氮菌的初步篩選

從歐李根系內分離出20株內生固氮菌，分別為NS1 14-2，NS1 14-1，NS 8，NS 22，NS 25，NS 26，YNS 3，YNS 10，YNS 6，YNS 1，YNS 4，WNS 26，WNS 24，WNS 22-1，WNS 21，NNS 15，NNS 18，NNS 17，NNS 14和NNS 19。

2.2 歐李內生固氮菌固氮酶活性

對20株歐李內生固氮菌的固氮酶活性進行測定發現，固氮酶活性范圍在31.45～424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1之間，其中菌株NS 25固氮酶活性(424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1)顯著高于其他菌株(P<0.05)。其次為菌株NS1 14-2(323.36 nmol C2H4·h-1·mL-1)和菌株NS1 14-1(305.63 nmol C2H4·h-1·mL-1)。此外固氮酶活性在200～300 nmol C2H4·h-1·mL-1之間的菌株有7株，分別為NS 8，NS 26，YNS 6，YNS 1，WNS 21，NNS 15和NNS 19。其他菌株固氮酶活性均小于200 nmol C2H4·h-1·mL-1。結果表明歐李根內具有豐富的固氮微生物資源(圖1)。

圖1 歐李內生固氮菌固氮酶活性

2.3 歐李內生固氮菌溶磷和分泌IAA特性

通過測定20株內生固氮菌合成植物生長素IAA能力發現，植物生長素IAA合成量在3.86～47.00 μg·mL-1之間，菌株NS 22合成IAA量(47.00 μg·mL-1)顯著高于其他菌株(P<0.05)。其中合成IAA量大于20 μg·mL-1的菌株有5株分別為NS1 14-2，NS 22，NNS 18，NNS 17和NNS 14(圖2)。

圖2 歐李內生固氮菌分泌IAA

分離菌株解有機磷量在26.62～99.18 μg·mL-1之間，各菌株培養液pH在3.42～5.52之間，菌株YNS 4(99.18 μg·mL-1)，NS 8(78.45 μg·mL-1)和YNS 6(72.88 μg·mL-1)解有機磷量顯著高于其他菌株(P<0.05)，剩余菌株解有機磷量均小于65 μg·mL-1(圖3)。分離菌株溶無機磷量測定中，各菌株培養液pH值在5.33～6.82之間，菌株WNS 21(20.31 μg·mL-1)和NNS 14(16.12 μg·mL-1)溶無機磷量顯著高于其他菌株(P<0.05)，剩余菌株溶無機磷量均小于17 μg·mL-1(圖4)。供試的20株內生固氮菌均能夠同時解有機磷和溶無機磷，不同菌株溶磷量不同。另外，這些內生固氮菌表現出解有機磷量大于溶無機磷量。

圖3 歐李內生固氮菌解有機磷

圖4 歐李內生固氮菌溶無機磷

2.4 歐李優良內生固氮菌初步鑒定

篩選10株固氮酶活性大于200 nmol C2H4·h-1·mL-1的菌株進行鑒定，將測序結果在Ezbiocloud數據庫中與模式菌株進行相似性比對。結果顯示，菌株NS1 14-1，NS1 14-2與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)模式菌株相似度分別為99.38%和98.90%，并處于同一進化分支；菌株NS 25和NS 26與副地芽孢桿菌(Bacillusparalicheniformis)模式菌株相似度分別為99.11%和98.77%，并處于同一進化分支；菌株YNS 1與耐寒短桿菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)的相似度為99.11%，并處于同一進化分支；菌株WNS 21，NNS 15與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)模式菌株相似度分別為99.14%和99.36%，并處于同一進化分支；菌株NS 8與梓樹類芽孢桿菌(Paenibacilluscatalpae)模式菌株相似度為98.47%，并處于同一進化分支；菌株YNS 6與堅強細胞芽孢桿菌(Cytobacillusfirmus)模式菌株相似度為98.86%，并處于同一進化分支；NNS 19與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)相似度為99.05%，與副地芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌模式菌株處于同一進化分支(圖5)。

圖5 基于16S rDNA基因序列構建10株內生固氮菌系統發育樹

3 討論

高效利用固氮微生物的前提是優良菌株的挖掘與鑒定。本研究以歐李根系為研究材料，利用無氮培養基，分離獲得20株內生固氮菌。從中篩選出10株固氮酶活性在200～450 nmol C2H4·h-1·mL-1之間的菌株，通過16S rDNA基因序列進行比對，這10株內生固氮菌分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、細胞芽孢桿菌屬(Cytobacillus)和短桿菌屬(Brevibacterium)。類芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬曾多次從小麥、珠芽蓼、蠶豆和馬鈴薯等植物中獲得[27-31]。說明該菌屬在植物體內生長數量多,是內生固氮菌的優勢菌群，具有較強的地域廣泛性和作物適應性，這對于今后微生物接種劑的生產應用具有重要意義。

在固氮酶活性測定中，固氮酶活性最高為菌株NS 25(424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1)。傅曉方等[32]從玉米中分離內生固氮菌，固氮酶活性最高為591.9 nmol C2H4·h-1·mL-1；李倍金等[33]從高羊茅根系中分離內生固氮菌，固氮酶活性最高為2 865 nmol C2H4·h-1·mL-1，表明宿主植物種類不同，可能是內生固氮菌固氮酶活性出現差異的原因之一。此外內生固氮菌NS 25被初步鑒定為副地芽孢桿菌，然而目前關于副地芽孢桿菌的固氮能力的研究卻鮮見報道。Ramírez-Cario等[34]研究發現副地芽孢桿菌對致使植物感染枯萎病的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和早疫病的鏈格孢(Alternariaalternata)均具有一定的拮抗能力[35]。Anand等[36]將固氮菌接種于鳳梨后，可顯著增加其葉片中的氮含量。推測該菌株在為歐李提供氮源方面發揮出積極作用外，對歐李真菌性病害的發生也具有一定的防治作用。

本研究從歐李根系中分離的內生固氮菌，除具有豐富的固氮酶活性之外，還兼具分泌IAA和溶磷的能力。分泌植物生長素IAA的菌株可通過刺激植物根毛形成，增加側根和主根數量及長度，形成一個高度分枝的根系系統，從而增強植物對礦質營養和水分吸收的能力，并為其他有益微生物附生創造有利條件[37]。Ying等[38]研究發現,IAA產生菌(Pseudomonassp.和Burkholderiasp.)使擬南芥幼苗根系高度分枝，根系變長。本研究分離的內生固氮菌均具有合成IAA的能力，如將這些菌株接種于歐李根部，對于歐李在極端環境下吸收更深層土壤中的水分和營養物質，同時對其固著土壤，發揮治理水土流失的生態作用具有重要意義。有研究證明，具有溶磷作用的內生菌，能夠對土壤中有機磷與難溶性磷酸鹽進行溶解[39]，有利于宿主植物在磷素較少的土壤中生長。陸藍翔等[40]從樟樹中分離獲得2株溶磷能力較強的菌株(ZS-1和ZS-3)，在接種樟樹扦插苗后，可有效地促進其生長。本研究分離的內生固氮菌解有機磷量最高為99.18 μg·mL-1，溶無機磷量最高為20.31 μg·mL-1。說明此次分離的內生固氮菌株還可通過提高歐李對環境中磷元素吸收利用來促進其生長。

另外，綜合20株內生固氮菌在固氮酶活性、分泌IAA和溶磷特性測定結果發現，部分不同種屬菌株、相同種屬菌株間的特性測定結果存在差異，這可能與菌株自身遺傳特性有關[41]。此外，不同菌株對最適生長的培養基組分和培養條件的需求存在很大差異[42]，可能也會導致此現象的發生。

4 結論

本研究從歐李根系中分離獲得的20株內生固氮菌具有固氮酶活性和其他特性(溶磷和分泌植物生長素IAA)，對歐李的生長具有一定的促生潛力。從中篩選10株優良內生固氮菌經鑒定共有芽孢桿菌屬(Bacillus)7株、短桿菌屬(Brevibacterium)1株、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)1株和細胞芽孢桿菌屬(Cytobacillus)1株。本試驗豐富了固氮微生物接種劑菌種資源庫。