不同秋眠級苜蓿越冬前后葉片光合作用的比較研究

張浩陽， 劉美君*，衛丹丹，苗 宇，張麗佳

(1. 新疆農業大學草業學院，新疆草地資源與生態實驗室，新疆 烏魯木齊 8320052；2. 忻州師范學院，山西 忻州 034000)

紫花苜蓿以其環境適應能力強、草質優、產量高和水土保持能力強等優點，被冠以“牧草之王”的美稱[1-3]，在新疆廣泛種植。由于新疆特殊的地理氣候條件，冬季低溫、春凍寒潮等極端天氣時有發生，影響苜蓿的順利返青，嚴重制約新疆苜蓿產業的發展。因此，篩選抗寒性好、返青率較高的苜蓿品種，研究其抗寒性機制，能夠為提高苜蓿越冬、返青率的研究提供理論支持，對于新疆的苜蓿產業發展有重要的意義[4-8]。

秋眠性是與日照變化有關的一種秋季生長特性，是對短日照的一種生長反應，大量的研究表明，秋眠等級與越冬率之間存在著極顯著負相關的關系，目前，秋眠級是評價苜蓿越冬能力的重要指標之一[9]。同時，秋眠性是苜蓿對晚秋生長環境變化的一種適應性反應，也是實現越冬、返青等過程的關鍵基礎[10]。董靜華等[11]研究表明苜蓿的秋眠級別與越冬性呈顯著負相關；Brouweretal等指出植株的高度與凍害、冷害呈正相關[12]。然而不同秋眠級的苜蓿在相同環境下到達各個生育期時間不同，秋眠級越低的品種，其進入各個生育期時間也會越晚，反之則會提前[13]。王曉龍[14]等研究結論說明，秋眠級低的苜蓿品種越冬能力相對更強，可以更好適應寒冷的環境。盧欣石[15]對國內23個審定苜蓿品種及92個地方品種的秋眠級別進行了測定，發現苜蓿秋眠級別與其耐寒能力有直接關系，秋眠性強，抗寒能力較強。但是苜蓿秋眠級影響其抗寒性的作用機理至今尚不明確。

光合作用是植株生產力的重要過程，也是限制作物產量的關鍵因素[16]。同時光合作用的日變化是植物生產過程中物質積累、生理代謝以及能量轉化的基本單元[17]。低溫會直接損害植物的光合器官，降低其光能同化率，對植物造成嚴重傷害[18]。隨著低溫脅迫時間的延長，植物凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)等光合參數會持續下降，但當低溫脅迫解除，光合參數都會有明顯回升[19]。王瑞霞[20]等研究表明，低溫脅迫下，小麥的光合速率、蒸騰速率以及氣孔導度都會出現顯著下降；煙草葉片在低溫脅迫后，出現凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)與氣孔導度(Gs)下降，導致同化物積累量下降；同時氣孔收縮度增大，抑制氣體交換，導致胞間CO2濃度(Ci)降低，造成光合產物合成原料不足[21]。并且在低溫脅迫下會影響到葉片光能的吸收、轉換與光合電子傳遞，致使過剩的激發能大量積累于PSⅡ反應中心，進而損傷植物葉片的PSⅡ反應中心，導致光合作用能力減弱。此外，前人研究發現熒光參數可以反映苜蓿抗寒性的強弱[22]，因此，通過研究光系統Ⅱ的活性可以反映葉片光合器官的活性。其中葉片的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)，PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)均隨著低溫脅迫時間延長出現顯著下降[23-27]。但是相關研究中關于越冬過程中不同秋眠級苜蓿光合活性的差異研究內容較少。

因此，本研究從紫花苜蓿葉片光合活性角度出發，通過對2種不同秋眠級的紫花苜蓿越冬前后的光系統活性、光合速率以及氣孔結構的測定，研究了不同秋眠級紫花苜蓿越冬前后葉片光合活性的變化差異，闡明苜蓿秋眠級影響其抗寒性的作用機理，以期為苜?？购贩N的選育和高產栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在新疆農業大學三坪實踐教學基地，位于歐亞大陸腹地，天山山脈北坡，屬新疆維吾爾自治區烏魯木齊市；大陸性干旱、半干旱性氣候；海拔850 m；年均溫度6.5℃，年極端最高溫度38.8℃，年極端最低溫度-41.5℃；冬季有積雪，年降水量230 mm，年蒸發量2570 mm；土壤凍結期11月中旬，解凍期3月中旬，無霜期150 d左右，共設置20個小區，每個小區長4 m，寬3 m，播種行距30 cm，每小區播10行。2017年5月播種，人工開溝條播，播深2 cm，播種量1.5 kg·畝-1。采取常規的田間管理措施，人工除草。

1.2 供試品種

供試紫花苜蓿品種為準格爾和勁能806。準格爾是一種優良紫花苜蓿品種，其秋眠級為1級，勁能806秋眠級為8級[28]，由于新疆冬季積雪較厚，對苜蓿根莖有保溫作用[29]，通過前期實驗可以確定兩個品種都可以實現安全越冬。

1.3 測定指標和方法

1.3.1基本光合參數測定 于2018，2019和2020年10月，采用Ciras-2便攜式光合儀，選擇晴朗無云天氣，選取小區內長勢均勻的植株，從9:30到20:00，監測不同秋眠級紫花苜蓿的倒數第3片完全展開葉，測定指標為葉片的光合速率(Pn)。用于研究不同秋眠級紫花苜蓿光合作用的日變化。

分別于越冬前2018，2019和2020年10月下旬和越冬后5月上旬，采用Ciras-2便攜式光合儀，選擇晴朗無云天氣，分別在10:00，13:00，16:00，在各時間點測定重復3天，選取小區內長勢均勻的植株，監測紫花苜蓿的倒數第3片完全展開葉，測定指標為葉片的光合速率(Pn)、蒸騰速率(E)、氣孔導度(Gs)以及胞間CO2濃度(Ci)，用于分析越冬前后不同秋眠級紫花苜蓿光合速率的差異。

1.3.2葉綠素熒光參數測定 于 2018，2019和2020年5月，采用Handy PEA進行測定，選擇晴朗無云天氣，選取小區內長勢均勻的植株，從9:30到20:00，測定相同葉位葉片(植株頂端第一個完全展開三葉的中間小葉)。測定前，用葉夾暗適應葉片20 min，每2 h測定1次。每個品種重復10次。用于分析不同秋眠級紫花苜蓿光系統Ⅱ活性日變化特征，主要測定指標為最大光化學效率(Fv/Fm),葉片光合性能指數(PIabs)。

于2018，2019和2020年10月下旬和越冬后5月上旬，選擇晴朗無云天氣，選取小區內長勢均勻的植株，使用Handy PEA進行測定，分別在10:00，13:00，16:00，測定相同葉位葉片(植株頂端第一個完全展開三葉的中間小葉)。測定前，用葉夾暗適應葉片20 min。每個品種重復10次，每個時期測定3 d。用于分析越冬前后紫花苜蓿葉片光系統Ⅱ活性的差異，主要測定指標為最大光化學效率(Fv/Fm),葉片光合性能指數(PIabs)。

1.3.3氣孔結構觀察及參數測定 于2018，2019和2020年10月下旬和3月下旬越冬中、越冬后5月上旬，分別采樣，使用NIkon SMZ1000顯微鏡分別觀察兩品種處理前和恢復后的氣孔結構變化及氣孔長度、寬度、氣孔孔徑寬度及長度的指標變化。

1.4 數據分析

根據上述測定方法，除了特定時間點測量的光合參數是以重復3 d進行測定以外，其余每年每個品種測定10次重復。由于光合日變化3年變化趨勢相似，本文選取較為典型其中一年的相關數據進行分析。其余所使用數據采用3年平均值，使用Excel軟件和SPSS17.0統計軟件進行數據處理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同秋眠級苜蓿光合速率日變化特征

不同秋眠級苜蓿葉片光合速率(Pn)的日變化整體趨勢相近，呈現三鋒曲線，如圖1所示。清晨苜蓿葉片的光合速率開始緩步上升，勁能806和準格爾的Pn值于10：00達到第一個高峰，峰值分別為2.6和4.0 μmol·m-2·s-1；勁能806和準格爾的Pn的第二個峰值分別出現在13：00和14：00，峰值分別為10.9和8.6 μmol·m-2·s-1；勁能806和準格爾的Pn的第三個峰值分別出現在16：00和18：00，峰值分別為11.6和12.2 μmol·m-2·s-1。這表明，上午隨著光照強度增強，苜蓿的光合速率隨之增加；午間出現光合速率的下降，可能是由于光合“午休”的出現或是發生強光光抑制；而隨著時間推移，光照強度下降，光合速率回升，直到18：00光照強度下降，光合速率也隨之降低。

圖1 不同秋眠級紫花苜蓿光合速率日變化特征

2.2 不同秋眠級紫花苜蓿光系統Ⅱ活性日變化特征

葉片光系統Ⅱ的最大光化學效率(Fv/Fm)反映了苜蓿葉片光系統Ⅱ的活性。如圖2A所示，不同秋眠級苜蓿的Fv/Fm整體變化趨勢相同，在9：00點時，勁能806和準格爾的Fv/Fm值分別為0.73和0.65，隨后勁能806開始緩慢下降，而準格爾的Fv/Fm先上升后下降。勁能806和準格爾的Fv/Fm分別于10：30和15：00以后開始趨于穩定，勁能806和準格爾的Fv/Fm分別在10：00(15：00)和12：00達到最小值；勁能806和準格爾當日Fv/Fm最小值分別為0.66和0.59，于15：00以后兩品種都開始上升，到晚上21：00之前一直在不斷上升。而勁能806苜蓿和準格爾苜蓿的Fv/Fm最高值都在晚上21：00出現，分別是0.85和0.84；勁能806苜蓿的最低值是在10：00，15：00，都為0.66，而準格爾苜蓿是12：00，為0.59，所以通過對比可以看出準格爾苜蓿Fv/Fm變化幅度較大。

圖2 兩品種Fv/Fm日變化特征(A)、PIabs日變化特征(B)和Fv/Fm與PIabs落差幅度(C)

不同秋眠級紫花苜蓿的葉片光合性能指數(PIabs)整體變化趨勢相近。清晨兩品種的PIabs變化平穩，而勁能806苜蓿從9：00后開始下降，12：00時降到最低點，而準格爾苜蓿從10：00后下降到最低點。準格爾和勁能806的PIabs分別在12：00，15：00以后開始出現快速上升，這時由于光照強度開始降低，光抑制程度逐漸減弱。勁能806和準格爾的PIabs值分別于15：00和12：00到達谷底，最小值分別為0.22和0；相比勁能806，準格爾的PIabs值上升得慢，勁能806在午后的上升速率明顯大于清晨下降速率；兩個品種苜蓿到21：00仍持續上升，勁能806上升速率下降，而準格爾上升態勢不變，且勁能806和準格爾的PIabs值達到測定時間內的最大值，分別是4.3和2.8，明顯大于清晨葉片的PIabs值。根據兩個品種的葉片單日Fv/Fm和PIabs值相比較的結果可以看出，準格爾和勁能806的PIabs值相對Fv/Fm值變化更加敏感。

2.3 越冬前后不同秋眠級紫花苜蓿光合速率Pn，E，Gs，Ci的對比

依據以上不同秋眠級紫花苜蓿葉片光合速率(Pn)的日變化規律，在越冬前后分別選10：00，13：00和16：00三個典型時間點代表上午、中午和下午對苜蓿光合速率相關指標進行測定，研究越冬前后不同秋眠級苜蓿光合活性的差異。如圖3A所示，圖中的勁能806與準格爾苜蓿相比，在越冬前準格爾苜蓿的光合速率較低，結果表明，苜蓿品種的秋眠級越低，光合速率越低，生長越慢。與越冬前相比，在越冬后勁能806和準格爾葉片的Pn值更高，且準格爾較勁能806光合速率更高。這表明，越冬后氣溫等環境條件的不斷恢復，苜蓿恢復生長，并且秋眠級較低的準格爾相較于勁能806的光合能力和光合速率恢復較快。

兩品種苜蓿越冬前后的蒸騰速率(E)、氣孔導度(Gs)以及胞間CO2濃度(Ci)也呈現很大差異。

如圖3B所示，蒸騰速率(E)，越冬前苜蓿葉片的蒸騰速率先增加，13：00時達到最大值，16：00時下降，且準格爾葉片蒸騰速率變化幅度比勁能806變化幅度更大。這表明準格爾葉片對環境變化更為敏感；越冬后兩品種的苜蓿葉片的蒸騰速率在一天內逐漸增加。越冬前后，準格爾葉片蒸騰速率明顯都低于勁能806。

從圖3C中的Gs(氣孔導度)值可以看出上午兩個不同品種苜蓿葉片越冬前的氣孔導度都明顯高于越冬后，除勁能806在13：00出現相反情況；同時在下午16：00兩個品種苜蓿葉片越冬前的氣孔導度略大于越冬后，但差異不顯著；中午準格爾葉片氣孔導度在越冬前和越冬后無顯著差異，而勁能806越冬前顯著小于越冬后。

如圖3D所示，越冬前，兩個不同品種的苜蓿的胞間CO2濃度呈U型日變化，即上午下午較高而中午下降。且兩個品種苜蓿葉片Ci在同一時間無顯著差異。越冬后，準格爾苜蓿葉片在三個時間段內Ci差異較小，而勁能806葉片Ci在中午達到最大值。同時兩個品種的苜蓿的越冬前Ci值明顯高于越冬后的值。

圖3 不同秋眠級紫花苜蓿越冬前后光合速率(Pn)、蒸騰速率(E)氣孔導度(Gs)以及胞間CO2濃度(Ci)的對比

2.4 越冬前后不同秋眠級紫花苜蓿光系統Ⅱ活性的對比

根據不同秋眠級紫花苜蓿葉片光系統 Ⅱ 的最大光化學效率(Fv/Fm)和葉片光合性能指數(PIabs)的日變化規律，在越冬前后分別選擇10：00，13：00和16：00這3個典型時間點對苜蓿進行測定，對比越冬前后不同秋眠級紫花苜蓿光合活性的差異。圖4A和圖4B是越冬前后勁能806苜蓿和準格爾苜蓿的Fv/Fm和PIabs對比圖。與越冬前相比，越冬后勁能806的Fv/Fm和PIabs顯著升高。在越冬前，勁能806的Fv/Fm和PIabs較準格爾的Fv/Fm和PIabs要偏高；但在越冬后，勁能806的Fv/Fm和PIabs較準格爾的Fv/Fm和PIabs偏低。這表明，準格爾苜蓿葉片光合活性有較強的低溫抗性；同時在越冬后，準格爾光合活性的恢復能力比勁能806更強。

圖4 勁能806、準格爾苜蓿越冬前后光合活性的對比

2.5 越冬前后不同秋眠級紫花苜蓿氣孔結構的對比

通過對比可以發現，處理前兩品種的苜蓿整個氣孔形態飽滿，輪廓較為清晰；但經過低溫處理后，氣孔整個形態發生較大變化，保衛細胞發生變形，氣孔變窄、縮短，出現畸形氣孔，限制了CO2進入葉肉細胞，從而對光合作用產生較大影響；而恢復后兩品種的苜蓿葉片的氣孔形態發生恢復，保衛細胞恢復正常形態，氣孔功能逐步恢復正常(圖5)。

圖5 不同秋眠級紫花苜蓿模擬越冬前后氣孔結構變化的對比

通過圖6中處理前后及恢復后氣孔各項數值對比可以看出，其整體呈現U型走勢變化，且兩品種紫花苜蓿不論是氣孔寬度、長度以及孔徑寬度、長度都在越冬過程中出現了明顯的下降趨勢，而越冬后則存在明顯的恢復，準格爾苜蓿較勁能806氣孔各項數值整體恢復較快，說明其對低溫的抗性高于勁能806。并且與圖5中相比較可以發現，在越冬中的低溫環境會導致氣孔結構的發生明顯的變化，引起氣孔長度、寬度及其孔徑開度、寬度的下降，從而導致氣孔導度的下降，進一步影響苜蓿葉片內CO2濃度，最終使得苜蓿的光合能力受到影響。

圖6 不同秋眠級紫花苜蓿模擬越冬前后氣孔長度(A)、寬度(B)及孔徑長度(C)和寬度(D)的對比

3 討論

Fv/Fm和PIabs反映了光系統Ⅱ的活性。許多研究已證明光系統Ⅱ是光抑制發生的重要部位，不同的脅迫如強光、干旱、冷害和熱害等都會導致PIabs值下降，從而使植物更易受到光抑制的傷害[30]。本研究發現，不同秋眠級的苜蓿的Fv/Fm和PIabs的變化規律是呈現U型變化趨勢，清晨兩品種的PIabs變化平穩；勁能806和準格爾的PIabs值分別于15：0和12：00到達最低；直到20：00恢復。這表明，在正常田間管理條件下，中午由于強光照射，紫花苜蓿葉片也不可避免的發生光抑制，導致PSⅡ活性的下降，由于苜蓿葉片自身的光破壞防御作用[31]，使得葉片PSⅡ的活性在晚上沒有強光照射時會自行恢復。

植物的PIabs是光合性能指數，反映植物光系統Ⅱ的活性。Fv/Fm為開放的PSⅡ反應中心捕獲激發能的效率，Fv/Fm的變化代表PSⅡ光化學效率的變化，以吸收光能為基礎的性能指數PIabs可以更準確地反映植物光合作用的狀態，是光抑制程度的一個重要指標，其比值越高表明光抑制的程度越低，是研究植物脅迫的重要參數[32]。本文中越冬前準格爾的葉片單日PIabs值的極差值為2.8，單日波動幅度較大。越冬前準格爾的葉片單日Fv/Fm值的極差值較小，單日的波動浮動較小。這表明在本研究中PIabs相較于Fv/Fm對于苜蓿葉片所處的環境變化更為敏感，與前人研究結果相似[33]。

光合日變化隨植物種類和環境條件的不同而變化，是分析環境因素影響植物生長和新陳代謝的重要手段之一。本文中苜蓿的葉片凈光合速率呈現三峰曲線，這與韓清芳[34]等的試驗結果一致。三個峰值分別出現在10:00，13:30和16:30左右。李超[35]等發現了苜蓿日凈光合速率變化的兩個峰值分別為10:00和14:00。兩品種紫花苜蓿在13:00—16:30之間Pn出現顯著降低，可能與“午休”現象有關。本實驗中出現光合“午休”是植物對于炎熱自然條件的生態適應和自我調節機制的表現。不同條件下引起光合作用午間降低的因素也不同。研究結果表明，早晨光照強氣溫低，凈光合速率也很低，但隨著光合有效輻射的增大，氣溫顯著升高，氣孔開放程度增加，苜蓿葉片凈光合速率明顯提高；中午高溫導致凈光合速率下降，下午隨著環境中溫度、光照強度不斷下降，光合能力處在不斷恢復過程中，從而使下午的峰值低于上午的峰值。同時本研究指出，兩個品種越冬前Ci都顯著高于越冬后，但越冬后苜蓿葉片光合速率顯著高于越冬前，這表明，越冬前后光合速率受到不同的因素影響，其中氣孔因素是由于中午田間光照、溫度和濕度等環境因子的變化引起植物氣孔的部分關閉，CO2進入葉片受阻而使光合下降；而非氣孔因素是由于葉肉細胞自身羧化酶活性的下降而引起Pn的降低[36]。越冬前，光合速率較低，但氣孔導度和胞間CO2濃度較高，氣孔孔徑也沒有出現明顯變化，氣孔結構也未有較大改變，以上說明，越冬前苜蓿葉片光合主要受葉肉羧化效率的影響，即非氣孔限制。越冬后，隨著光強的增強，苜蓿葉片光合速率逐漸增加，但是，氣孔導度和胞間CO2濃度增加程度較低，同時氣孔孔徑出現了明顯的皺縮變窄，氣孔形態也發生了改變，這表明越冬后可能是由于低溫導致苜蓿葉片光合速率下降，也可能是返青期葉片發育的原因導致氣孔開度不足，從而使光合作用受到氣孔限制。

苜蓿的秋眠性是其對秋季環境變化的一種適應性反應[34]，與品種產量和適應性之間的具有密切關系。不同秋眠級的兩品種紫花苜蓿在越冬前和越冬后的光合作用有顯著差異。越冬前秋眠級較高的勁能806光合速率較大，生長更快。越冬后兩品種間差異較小，但秋眠級較低的準格爾因為氣孔恢復較快，光合恢復也更快，所以其光合速率較高。說明秋眠級較低的準格爾擁有較好的抗低溫的能力。

4 結論

光合速率日變化趨勢呈三峰曲線，而苜蓿葉片光系統Ⅱ活性的日變化趨勢呈U型曲線。不同秋眠級苜蓿越冬前后光合作用差異顯著，其中秋眠級較高的苜蓿葉片光合速率比較高。越冬前苜蓿葉片光合作用主要受到非氣孔限制，越冬前秋眠級較高的苜蓿光合活性較高，生長較快。而越冬后則是由于氣孔結構受到低溫以及氣孔自身發育的影響，光合作用受到氣孔限制。秋眠級低的苜蓿氣孔結構恢復較快，光合作用恢復更快，有較強的抗低溫性。