天目湖流域溝塘濕地脫氮速率的時空差異

王子聰，許 海，詹 旭，朱廣偉，朱夢圓，康麗娟,3，趙 鋒，唐 偉，趙星辰,3

1. 江南大學環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122

2. 中國科學院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環境國家重點實驗室，江蘇 南京 210008

3. 中國科學院大學，北京 100049

氮是水生態系統重要的生源要素[1]，通常被認為是水體初級生產力的關鍵限制因子之一[2]. 近30年來，人類活動使得大量活性氮進入水體，顯著改變了水體的氮平衡，導致水體富營養化加劇、有害藻類水華擴張[3]. 面源污染是湖庫(如太湖、滇池、巢湖)氮素的主要來源[4]，50%以上的氮負荷都來自面源污染[5-7].因此，削減流域面源污染是湖庫富營養化控制的關鍵.

濕地與森林、海洋并列為全球三大生態系統類型，其在涵養水源、蓄洪調峰、凈化水質、維護生物多樣性等方面起到了重要作用[8-10]. 在以農業用地為主的水庫流域中，分布著大量天然或人工排水的溝渠、池塘，其能夠通過截留、沉積和凈化作用減少向下游輸入的污染物負荷，以達到改善水質的目標[11-13]. 反硝化[14-16]與厭氧氨氧化[14,17-18]作用是厭氧菌利用水中溶解性無機氮(DIN)進行生物反應，最終將DIN轉化為N2排出水體的脫氮反應，是水體氮凈化的關鍵過程. 然而，目前關于溝塘濕地的脫氮報道多局限于氮的表觀去除率方面，深入具體脫氮機制的報道較少[12-13,19]；而且，溝塘濕地的脫氮機制研究多集中于農田池塘、養殖塘、果園溝渠等的反硝化作用[20-23]，對厭氧氨氧化作用研究偏少[24-25]. 由于不同溝塘濕地的底物濃度、形態構造、生物組成等都可能存在差異，進而影響其脫氮能力[11,26-27]，故需要加強對不同溝塘濕地脫氮速率及脫氮機制的深入研究.

天目湖沙河水庫地處長江中下游流域，屬于典型的丘陵山區農業流域，流域主要土地利用類型為林地(占比為54%)、農田(占比為16%)、茶園(占比為10%)[13,28]. 流域內茶園氮污染嚴重，單位公頃有機肥施用達到958.5 kg(以N計)，是農業施肥的兩倍，氮流失強度可達103.08 kg/(hm2·a)[29-30]；果園氮污染同樣嚴重，氮肥施用可高達1 400 kg/hm2(以N計)[22]；在江浙丘陵地區農村，生活污水大多都直接排放或經過化糞池簡單處理后排放進入環境，對地表水環境造成較大壓力[31]. 目前，茶園、果園這類高污染土地利用類型周邊溝塘濕地的反硝化與厭氧氨氧化作用研究較少，導致在水庫流域氮管理方面缺乏相應依據.

基于此，該研究于天目湖沙河水庫主要入庫河流-平橋河流域，采集了流域內典型土地利用類型下溝塘濕地無擾動泥-水柱進行流動培養，并利用同位素配對技術結合膜接口質譜儀，測定反硝化速率與厭氧氨氧化速率，以闡明流域內各溝塘濕地脫氮速率及厭氧氨氧化作用對脫氮的貢獻，同時探討影響脫氮的限制性因素，以期深入了解溝塘濕地的氮滯留機制，為流域氮污染控制和水質目標管理提供科技支撐.

1 材料與方法

1.1 流域概況與采樣點布設

天目湖流域位于我國東南丘陵山區，地處亞熱帶季風區，降雨強度大，且多集中于3～9月，除生活建設用地外，流域內主要土地利用類型已由農田、養殖塘轉變為林地，主要經濟作物為茶葉與果樹[30,32]. 天目湖主要有3條入庫河流，分別為平橋河、下宋河和中田河，平橋河流域是沙河水庫流域上游的一個重要水源涵養地，流域水質主要受茶園種植、農業生產、生活污水和畜禽養殖影響[28]. 因此，在平橋河流域分別選取了流域內典型土地利用類型周邊的溝渠、池塘作為研究對象，分別為茶園退水池塘、果園排水溝渠、生活污水排放池塘和入湖口河流濕地，分別簡稱為茶園池塘、果園溝渠、生活池塘和入湖河流(見圖1).其中，茶園池塘位于茶園種植區且周邊無其他因素影響；果園溝渠位于果園種植區中心地帶；生活池塘處于平橋村中心，周邊即為平橋村小學及居民生活區.

不同溝塘濕地基本結構如表1所示，各溝塘夏季水深有所升高，但總體變化不大，茶園池塘、果園溝渠、生活池塘和入湖河流平均水深分別為1.5、0.35、1.95、2.8 m. 濕地面積從大到小依次為入湖河流、生活池塘、茶園池塘，其中果園溝渠由于縱橫分布且寬度較小，故未統計面積. 果園溝渠周邊水生植物主要為菖蒲屬和苦草屬植物；入湖河流兩岸水生植物主要為蘆葦屬和荇菜屬植物；茶園池塘和生活池塘周邊無水生植物，主要為陸生植物. 除生活池塘外，其余類型濕地均為非混凝土結構.

圖 1 天目湖流域采樣點的空間分布Fig.1 Spatial distribution map of sampling points in Tianmuhu Lake Basin

表 1 不同溝塘濕地的基本結構Table 1 Basic structure of different types of ditches and ponds

1.2 樣品采集與分析

該研究分別于2021年春季(3月)與夏季(6月)，在天目湖沙河水庫平橋河流域，使用有機玻璃柱狀采泥器(內徑79 mm)于各類型溝塘濕地中間位置采集無擾動原狀泥-水柱樣品，每個點位采集4根，每根原狀泥-水柱采集距離不超過1 m，其中沉積物深度為12～15 cm. 3根泥柱的兩端使用橡皮塞塞緊并注滿原位水，帶回實驗室進行流動培養，另1根現場切表層2 cm泥樣，放入自封袋帶回實驗室分析. 每個點位采集上覆水30 L作為流動培養用水，并使用多參數水質測定儀(YSI 6600 V2，美國Yellow Stone公司)測定上覆水溫度、pH和溶解氧(DO)濃度等.

水質指標測定參考文獻[33]，分別測定總氮(TN)、總磷(TP)、溶解性總氮(DTN)、溶解性總磷(DTP)、葉綠素(Chla)及溶解性有機碳(DOC)濃度；使用Skalar連續流動分析儀(荷蘭Skalar公司，SAN++型)測定硝態氮(NO3--N)、亞硝態氮(NO2--N)、氨氮(NH4+-N)和磷酸根(PO43--P)濃度，其中NO3--N、NO2--N及NH4+-N濃度之和記為溶解性無機氮(DIN)濃度；根據參考文獻[34]，測定沉積物中總氮(STN)及總碳(STC)含量；利用膜進樣質譜儀(MIMS)測定試驗水體中溶解的28N2、29N2及30N2的信號值[35].

1.3 室內流動培養

為盡可能地還原沉積物脫氮環境，試驗使用了原狀沉積物柱芯流動培養法[36]結合同位素配對技術，使沉積物處于一個封閉并且有持續進出水的體系中，以獲得更貼合實際的反硝化與厭氧氨氧化速率.

采集的原狀泥-水柱運回實驗室后，靜置于與現場水溫一致的恒溫水浴槽中，預培養一晚，使培養體系穩定. 整個試驗裝置如圖2所示，將帶有硅膠圈的O型密封圈塞入有機玻璃泥柱中，在沉積物上方構成一個270 mL上覆水的密閉體系. 活塞上方連有Peek管供體系進出水，其中進水管位于沉積物上方約1 cm處，出水管位于O型密封圈頂端，在保證進水不擾動沉積物的前提下，整個體系上覆水能夠充分混合. 進水管連接進水袋，在進水袋中加入0.4 mg/L的NaNO3，用以測定反硝化與厭氧氨氧化速率，同時避免高濃度的硝酸鹽破壞原位環境[37]. 出水管連接蠕動泵，流速設置為90 mL/h，趙鋒等[25]指出，該流速下培養體系較為穩定. 上述操作完成后，將培養泥-水柱放置于恒溫水浴槽中，恒溫避光培養3 d，每12 h取一次樣. 每次取樣時，使用Labco頂空進樣瓶(12 mL)同時采集進水與出水樣，并立即注射0.1 mL質量分數為50%的ZnCl2停止微生物反應，隨后使用膜進樣質譜儀(MIMS)測定水樣中溶解的28N2、29N2和30N2的信號值.

圖 2 原位泥-水柱流動培養示意Fig.2 Schematic diagram of in situ mud-water column flow culture

1.4 反硝化速率、厭氧氨氧化速率及厭氧氨氧化貢獻率的計算

近年來由于厭氧氨氧化作用的發現，經典的同位素配對技術不再適用. Risgaard-Petersen等[38]指出，由于厭氧氨氧化與反硝化過程的吸收動力學相似，故添加的硝態氮不會改變反硝化與厭氧氨氧化之間的比例.

Thamdrup等[39]指出，厭氧氨氧化作用生成N2所需的兩個氮原子分別由NO3--N與NH4+-N提供，而該試驗中NH4+-N并未被同位素標記，故厭氧氨氧化作用僅會利用14NO3--N和15NO3--N分別生成28N2和29N2. 因此，總厭氧氨氧化速率( Atot)可由式(1)計算得到：

式中：P29′與P′30分別為出水時29N2和30N2的信號值，μmol/L；P29與P30分別為進水時29N2和30N2的信號值，μmol/L；Fn為15N同位素豐度；υ為蠕動泵流速，mL/h；S為有機玻璃泥柱橫切面積，m2；μmol/(m2·h)；Atot為總厭氧氨氧化速率，μmol/(m2·h).

經典的同位素配對技術提出時，并未發現厭氧氨氧化的存在，故試驗生成的29N2實際上由反硝化與厭氧氨氧化作用共同生成，所以由反硝化作用生成29N2的速率需要總29N2生成速率(r29)減去厭氧氨氧化作用產生29N2的速率(A29)[40]：

式中：r29、r30分別為分子質量為29和30時N2的產生速 率，μmol/(m2·h)；D14、D15分 別 為 利 用14NO3--N和15NO3--N進行反硝化作用的反硝化速率，μmol/(m2·h)；D29、A29分別為反硝化與厭氧氨氧化作用產生29N2的速率，μmol/(m2·h). 最終，利用未被同位素標記的14NO3--N進行反應，反硝化速率(Dr)和厭氧氨氧化速率(Ar)分別如式(8)(9)所示，二者之和記為脫氮速率. 厭氧氨氧化作用對脫氮的貢獻率(Ra，簡稱“厭氧氨氧化貢獻率)如式(10)所示：

1.5 數據分析

首先對所需要分析的數據進行Shapiro-Wilk正態性檢驗和Levene方差齊性檢驗，然后對符合正態分布及方差齊性的數據利用單因素方差分析，探究不同溝塘濕地的脫氮速率是否存在顯著性差異. 利用Spearman相關性分析，探究溝塘濕地脫氮速率的影響因子.

2 結果與分析

2.1 不同溝塘濕地上覆水和沉積物的理化指標

各水體的理化性質如表2所示，春季(3月)，果園溝渠的TN濃度最高，為3.48 mg/L，入湖河流次之，生活池塘與茶園池塘最低. 在生活池塘中，TN濃度及NO3--N濃度最低，氮污染主要以有機氮為主，TP、NH4+-N、Chla和DOC濃度均最高.

夏季(6月)，TN濃度仍是果園溝渠最高達4.36 mg/L，茶園池塘TN濃度超過生活池塘，略低于入湖河流；所有類型水體NH4+-N濃度均較低，最大值僅為0.05 mg/L. 在生活池塘中，TP、Chla和DOC濃度依然最高，NO3--N濃度最低. 隨著溫度的上升，夏季各水體溶解氧均有所下降，其中茶園池塘上覆水中DO濃度僅為4.82 mg/L.

表 2 不同溝塘濕地上覆水及沉積物的理化參數Table 2 Physical and chemical parameters of overlying water and sediment in different ditches and ponds

各水體沉積物性質在春季與夏季無明顯變化，生活池塘和入湖河流的STN、SOC含量均最高，茶園池塘次之，果園溝渠由于較快的水流使得其STN、SOC含量最低.

2.2 不同溝塘濕地脫氮速率

圖 3 春季和夏季不同溝塘濕地的脫氮速率Fig.3 Nitrogen removal rates of different ditches and ponds in Spring and Summer

如圖3所示，各溝塘脫氮速率差異性顯著. 春季反硝化速率和厭氧氨氧化速率在生活池塘中均最低，分 別為(2.97±0.46)和(7.62±0.68) μmol/(m2·h)，遠小于其他溝塘濕地. 而反硝化速率在果園溝渠中最高，為(87.78±17.93) μmol/(m2·h)，厭氧氨氧化速率在入湖河流中最高，為(46.68±14.56) μmol/(m2·h). 脫氮速率從大到小依次為果園溝渠、入湖河流、茶園池塘、生活池塘，范圍為(10.59±2.45)～(107.65±37.44) μmol/(m2·h)，平均值為70.73 μmol/(m2·h).

夏季，隨著溫度的升高，脫氮速率有所升高. 反硝化速率和厭氧氨氧化速率在生活池塘中依然最低，分別為(17.50±1.90)和(14.57±3.05) μmol/(m2·h).不同于春季，夏季反硝化速率在茶園池塘最高，達(108.92±18.53) μmol/(m2·h)，而厭氧氨氧化速率在入湖河流中最高，為(63.77±7.03) μmol/(m2·h)，脫氮速率范圍為(32.07±2.89)～(150.1±38.09) μmol/(m2·h)，平均值為112.36 μmol/(m2·h).

由圖4可見，春季生活池塘和茶園池塘的厭氧氨氧化貢獻率較高，夏季分別下降了26.82%、14.98%；果園溝渠和入湖河流的厭氧氨氧化貢獻率在春季和夏季變化不大，平均值分別為21.17%、48.99%. 春季和夏季不同溝塘濕地的厭氧氨氧化貢獻率范圍分別為18.93%±8.13%～71.93%±4.09%、23.42%±4.95%～49.27%±4.1%，平均值分別為45.45%、36.26%.

圖 4 不同溝塘濕地厭氧氨氧化作用對脫氮的貢獻率Fig.4 Contribution of anammox to nitrogen removal of different ditches and ponds

3 討論

3.1 不同溝塘濕地脫氮能力的主要控制因素

相關性分析結果(見表3)表明，反硝化速率與NO3--N濃度呈顯著正相關(P＜0.05)，即上覆水中NO3--N濃度是反硝化速率的限制性因素，這在水塘[7]、入?？赱16]、河流[26]、湖泊[41]等中均有報道. 春季和夏季生活池塘的反硝化速率均較低，這主要是受到了NO3--N濃度的限制，而春季生活池塘的反硝化速率僅為2.97 μmol/(m2·h)，顯著低于其他水體，這主要是其較低的NO3--N本底值限制了反硝化作用的進行；同時，春季生活池塘較高的NH4+-N濃度會使亞硝酸鹽氧化作用受到抑制，導致硝化作用停止于NO2--N階段[42]，NO3--N供應的限制也是其反硝化速率極低的原因.

表 3 反硝化速率、厭氧氨氧化速率與環境因子間的相關性Table 3 Correlation between Denitrification and Anammox rates and environmental factors

如表3所示，DOC濃度與反硝化速率并不相關，SOC含量則與反硝化速率呈負相關. 其他研究多報道反硝化速率與有機碳濃度呈正相關[21,26,43]，但Zhong等[44]在太湖梅梁灣的沉積物添加碳源試驗中發現，碳對反硝化速率無明顯作用；李如忠等[7]在巢湖的研究發現，添加碳源對反硝化速率有明顯抑制作用，這一方面可能是與有機碳的有效性有關，另一方面可能是脫氮底物不足導致. 在夏季茶園池塘中，反硝化速率為108.93 μmol/(m2·h)，高于其他水體，但其NO3--N和有機碳濃度均非最值，說明在不受其他環境因素的限制下，水體較低濃度的DO能夠為沉積物反硝化過程提供合適的反應環境[7].

已有研究表明，厭氧氨氧化受到NO2–-N濃度的限制[16-17,45-46]，該研究的厭氧氨氧化速率也與NO2–-N呈顯著正相關(P＜0.05). 春季生活池塘的厭氧氨氧化速率最低，為7.62 μmol/(m2·h)，這可能是由于春季生活池塘較高的NH4+-N濃度會對厭氧氨氧化產生抑制作用[46]；同時，由于厭氧氨氧化菌不僅可以利用NO2–-N作為電子受體，還可以利用NO3–-N作為電子受體[25,47]，而春季生活池塘較低的NO3–-N濃度也會限制厭氧氨氧化作用的進行. 春季和夏季入湖河流厭氧氨氧化速率的平均值為55.23 μmol/(m2·h)，顯著高于其他研究水體，這一方面是由于入湖河流有著相較于其他水體最高的NO2–-N濃度；另一方面由于入湖河流較高的SOC含量能夠促進厭氧氨氧化反應底物的生成，從而提高厭氧氨氧化菌的生物量[48-49].

總的來說，作為反硝化與厭氧氨氧化作用的反應底物，DIN濃度是各類型水體脫氮的主要限制因素(見表3、圖3)，SOC含量在一定程度上也會影響脫氮速率的高低，較高的氣溫與較低的DO濃度均有利于反硝化作用和厭氧氨氧化作用的進行. 反硝化速率與厭氧氨氧化速率在不同水深、面積、植物覆蓋及結構特征方面并無明顯差距.

3.2 厭氧氨氧化在不同溝塘濕地的脫氮貢獻率

反硝化早期一直被認為是水體徹底脫氮的唯一生物途徑，直到21世紀伊始，厭氧氨氧化被發現存在于淡水水體中[17]，國內外學者由此展開大量研究并分析其對脫氮的貢獻率. 目前，沉積物反硝化速率和厭氧氨氧化速率測定方法多樣，其中常用的乙炔抑制法雖然方法簡單，但反硝化速率被低估早有報道[40]；而泥漿試驗盡管可以處理大量樣本，但其破壞了水-土界面的微環境，且添加高濃度同位素，也會對厭氧氨氧化貢獻率有所低估[37,50]. 已有研究[25,36]表明，采用流動培養法能夠極大地還原沉積物的原位環境，可獲得更貼合實際的反硝化速率和厭氧氨氧化速率.

該試驗結果顯示，不同溝塘濕地的厭氧氨氧化貢獻率范圍為18.93%～71.93%，說明不同溝塘濕地的沉積物間有著很強的差異性. 而在國內外的已有研究中，厭氧氨氧化貢獻率在不同類型水體中有著較大的變化，最低幾乎為0，最高可達90%[24]，如閩江入海河口為5.7%～29%[15]、上海城市河道為22.2%～48.0%[45]、白洋淀為0.67%～20.65%[18]、河床沉積物中最高可達58%[51]等. 該試驗采用的原位流動培養法即保留了水-土界面的微環境，也保證了沉積物在縱向上的完整性，同時添加了較低濃度的同位素，使得厭氧氨氧化貢獻率不被低估[38,50,52].

春季不同溝塘濕地的厭氧氨氧化貢獻率波動較大，范圍為18.93%～71.93%，最大值在生活池塘，最小值在果園溝渠；夏季生活池塘和茶園池塘的厭氧氨氧化貢獻率分別下降了26.82%和14.98%，而果園溝渠和入湖河流的厭氧氨氧化貢獻率變化不大. 由式(11)及圖3可見，厭氧氨氧化速率較反硝化速率季節性變化較小，因此不同季節的厭氧氨氧化貢獻率受反硝化速率變化的影響更大. 有研究指出，不同生境下脫氮細菌的最佳溫度并不相同[24]，但通常在一定范圍內，隨著溫度的上升，脫氮速率不斷升高[11]. 試驗結果顯示，反硝化速率和厭氧氨氧化速率均隨著溫度的上升而上升，但反硝化速率在生活池塘與茶園池塘上升更加迅速，使得池塘中的厭氧氨氧化貢獻率在夏季有所下降，說明在池塘這種相對靜止的水體中，反硝化菌對溫度上升的響應可能更加強烈.

3.3 溝塘濕地脫氮能力對流域氮管理的啟示

在水庫型水源地中，藻類的異常增殖常常威脅著水庫的水質安全，朱廣偉等[53]對天目湖沙河水庫的研究表明，當TN濃度低于1 mg/L時能有效限制藻類的生長，對流域氮的截留是控制天目湖藻類異常增殖的重要手段. 盡管流域內的溝塘濕地具有較高的脫氮速率[12-13]，但這些溝塘濕地往往種類較多且分散，給管理帶來很多困難[54]. 因此，該研究量化了流域內一些典型土地利用類型下溝塘濕地的脫氮速率，為天目湖沙河水庫流域氮管理以及沙河水庫水質管理提供參考；同時，在區域管理尺度上也是一個重要的補充.

以流動培養法為前提，夏季作為對比，溝塘濕地的脫氮速率大于多數水體，包括入海河口[55]、湖泊[25,41]、海灣[56]、微咸河流[57](見表4)，體現出流域內溝塘濕地脫氮的高效性. 根據各水體春季和夏季平均脫氮速率計算可得，生活池塘、茶園池塘、果園溝渠和入湖河流水體單位面積的脫氮能力分別為10.43、53.90、60.16和55.11 g/(m2·a)(以N計). Zhang等[13]指出，天目湖流域氮負荷約為2 186 t，據此計算，占地面積約為流域面積0.1%的入湖河流濕地就可脫除流域0.5%的氮負荷. 因此，建議在茶園、果園這類高污染土地利用類型周邊，可適當增加排水溝渠和退水池塘，以第一時間削減面源氮負荷；入湖河流濕地是面源污染進入水庫的最后一道屏障，應當有效推行退耕還濕，增加濕地面積以提高入湖水質；盡管生活池塘脫氮速率相對較低，但仍高于部分湖泊、河口及海灣[42,55-56]，也應受到重視.

總之，流域內這種小型的、分散的、天然或半人工的溝塘濕地是應對農業流域面源氮污染的重要手段，其能夠有效削減流域面源氮負荷以減少入庫氮素，進而減輕水庫內的水華風險，這種低投入高收益的用地應當受到重視及正確的管理.

表 4 夏季不同類型沉積物的脫氮速率和單位面積脫氮能力Table 4 Nitrogen removal rates and nitrogen removal capacity per unit area of different types of sediment in summer

4 結論

a) 天目湖流域茶園、果園的種植造成周邊水體氮素污染嚴重，主要以NO3--N為主；相比之下，農村生活區池塘氮污染以有機氮為主，且其DOC、TP濃度及STN、SOC含量均較高.

b) 天目湖流域內各溝塘濕地的脫氮速率均較高且季節性差異顯著，DIN濃度是脫氮的主要限制因素.

c) 天目湖流域內各溝塘濕地以反硝化作用與厭氧氨氧化作用共同脫氮，二者在河流相濕地中速率相當，而池塘、溝渠主要以反硝化作用脫氮.

d) 持續的氮供應使得天目湖流域內溝塘濕地始終保持較高的脫氮速率，說明溝塘濕地是重要的脫氮熱點之一，在該流域內應針對性地增加溝塘濕地.