水稻籽粒鎘積累KASP分子標記LCd-38的開發與利用

徐君， 李婷， 胡敏駿， 蔣玉根， 閆慧莉， 許文秀，虞軼俊， 何振艷*

（1.杭州市富陽區農業技術推廣中心，杭州 311400；2.中國科學院植物研究所，北方資源植物重點實驗室，北京 100093；3.中國科學院大學，北京 100049；4.浙江省耕地質量與肥料管理總站，杭州 310000）

鎘（cadmium，Cd）是一種劇毒的重金屬，半衰期為10～30年，可通過食物鏈在人體中富集，危害人類健康[1]。我國農用地鎘污染現狀不容樂觀，2020年《中國生態環境狀況公報》提出，影響農用地土壤環境質量的主要污染物是重金屬，其中鎘是首要污染物。水稻（Oryza sativa L.）是我國主要糧食作物之一[2]，在生長過程中易從土壤中吸收鎘，長期食用鎘污染的大米會導致嚴重的健康問題[3]。

鎘低積累水稻品種的選育可有效降低水稻籽粒鎘污染風險，實現鎘污染土地上的水稻安全生產，常用的方法包括常規選育和分子標記輔助選育[4]。常規選育基于不同品種的籽粒鎘積累表型進行篩選，其過程耗時長，易受到環境因素影響，表型穩定性差。分子標記輔助選育利用與鎘積累性狀緊密連鎖的DNA分子標記或功能標記，對鎘積累性狀進行間接選擇，再結合常規育種手段培育新品種。分子標記輔助選育具有高效、準確、結果穩定的優點，提升了篩選的準確性和穩定性，可降低育種成本[5]，是目前鎘低積累水稻品種選育的主要方法之一。

目前報道的籽粒鎘積累相關分子標記包括Tons和OsHMA3[4]。王天抗等[6]基于珞紅4A的7號染色體缺失片段處的插入序列（Tons）開發了分子標記，并利用開發的Tons分子標記檢測體系從珞紅4A與IR28雜交F2群體的后代中篩選到低鎘新材料Tonys。Takahashi等[7]以OsHMA3為分子標記從2個粳稻品種雜交衍生的F5世代篩選到鎘污染修復水稻材料Akita110。黃湘桂等[8]以OsHMA3作為分子標記，創制了基于創5S（C5S）背景的包含抗稻瘟病雙基因和鎘低積累基因OsHMA3的3基因聚合系。水稻籽粒鎘積累性狀是多基因控制的數量性狀，現有的水稻籽粒鎘積累相關分子標記遠不能滿足鎘低積累水稻品種選育的實際需求。隨著全基因組測序和全基因組關聯分析（genome wide association study，GWAS）的發展，在水稻中挖掘到大量籽粒鎘積累相關QTL（quantitative trait locus）[9-11]，為水稻籽粒鎘積累相關基因的篩選與分子標記的開發提供了重要參考。

分子標記的開發主要基于Southern雜交、PCR技術和測序技術等。限制性片斷長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）標記是以DNA/DNA雜交為基礎的第一代分子標記，由于檢測技術繁雜，難以應用到大規模育種實踐[12]。基于PCR技術的分子標記包括隨機擴增多態 性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）標記[13]、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記[14]和序列標簽位點（sequencetagged site，STS）標記[15]等二代分子標記，由于穩定性差、開發費用高，發展也受到了限制。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記是基于測序技術的分子標記[16-17]，與前兩代分子標記相比，具有密度高、結果穩定且可自動化分析的優點，已成為重要的、有前景的分子標記[18]。目前競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術在水稻分子標記輔助育種中廣泛應用[19-24]。KASP技術是基于已知SNP的高通量基因分型技術，可在廣泛的基因組DNA樣品中，對SNPs和特定位點上的InDels進行精準的雙等位基因判斷[25-26]，在大批量樣本基因型鑒定時具有顯著優勢[26]。

根據《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準》（GB 15618—2018）[27]，農田土壤分為優先保護類、安全利用類與嚴格管控類，其中，優先保護類土壤污染風險低，對食用農產品質量安全一般不構成威脅；嚴格管控類土壤污染風險高，原則上禁止種植食用農產品；安全利用類土壤可能存在不符合食用農產品質量安全標準的風險，采取安全利用措施（如種植低積累品種）等可降低該風險。

本實驗室前期根據水稻微核心種質材料的籽粒鎘含量全基因組關聯分析結果鑒定到鎘轉運基因OsCd38[9]，該基因參與籽粒鎘積累過程。本研究基于OsCd38基因上的籽粒鎘積累顯著相關功能性SNP位點TagSNP-20089955開發了KASP分子標記LCd-38，該標記可準確將不同品種分為高鎘基因型（CC）和低鎘基因型（TT）。利用LCd-38標記篩選適合安全利用類土壤種植的低鎘水稻品種，該標記對試驗地區不同主栽品種籽粒鎘積累特性的預測準確率為100%。因此，LCd-38分子標記可用于水稻籽粒鎘積累特性的早期預測，對鎘低積累水稻分子標記輔助育種具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與鎘處理

供試水稻材料共85份，來源于水稻微核心種質（mini-core collection，MCC）材料（由中國農業大學提供）[9]，包括38個粳稻品種、47個秈稻品種，可以較少的種質數量代表較大的遺傳變異[28]，其中，65個水稻品種（26個粳稻品種、39個秈稻品種）用于標記開發，剩余20個水稻品種（12個粳稻品種、8個秈稻品種）用于標記驗證。水稻材料播種在大田，待幼苗株高15 cm時移栽至10 L塑料桶（土壤同大田）中，用硫酸鎘（3CdSO4·8H2O）處理，處理水平為0.18 mg·kg-1。

1.2 水稻籽粒樣品采集與鎘含量測定

待水稻完全成熟后，收集水稻籽粒。收集的籽粒于40℃烘干3 d，脫殼后使用冷凍混合型研磨儀MM400（德國Retsch公司）粉碎；稱取0.2 g（精確到0.000 1 g）樣品放入消煮管中，加入1 mL HNO3冷消化過夜；用遠紅外控溫式消煮爐（LWY84B型，江蘇盛藍儀器制造有限公司）200℃消解8 h，定容至15 mL，過濾至10 mL離心管中待測；以大米粉成分分析標準物質（GBWE100349，鋼研納克檢測技術公司）為質控標準，確保數據準確可靠。采用電感耦合等離子質譜儀（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）測定籽粒鎘含量，每個樣品測量3次，取3次測定的平均值作為該樣品鎘含量的最終結果。

1.3 功能性SNP位點的篩選

基于前期鑒定的鎘轉運相關基因OsCd38，利用HaploView軟件對基因序列上的35個籽粒鎘積累相關SNP位點進行連鎖不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），以r2＞0.8為緊密連鎖指標，篩選水稻籽粒鎘含量顯著相關的標簽SNP位點。通過t檢驗分析各標簽SNP位點不同基因型對應的籽粒鎘含量之間是否存在顯著性差異，選取差異顯著的SNP位點作為功能性SNP位點。

1.4 KASP標記開發與引物設計

根據功能性SNP位點的等位變異設計KASP標記，根據SNP位點的側翼序列設計PCR擴增引物，包括特異性正向引物F1和F2，以及通用反向引物R（表1）。等位基因特異性引物各自具有對應于通用熒光共振能量轉移盒的獨特尾部序列，F1尾部用6-羧基熒光素（FAM）染料標記，F2尾部用六氯-6-甲基熒光素（HEX）染料標記。引物F1與通用引物的單鏈DNA分子用于擴增SNP位點為T的片段，用酶標儀或熒光定量PCR儀可讀取到模板中與FAM序列結合的熒光基團的熒光信號；引物F2與通用引物的單鏈DNA分子擴增SNP位點為C的片段，用酶標儀或熒光定量PCR儀可讀取到模板中與HEX序列結合的熒光基團的熒光信號。引物序列由中玉金標記（北京）生物技術股份有限公司合成。

表1 LCd-38分子標記引物序列Table 1 LCd-38 molecular marker primer sequence

1.5 分子標記的驗證

將浙江省杭州市富陽區的主栽水稻品種種植于安全利用類鎘污染土壤，插秧后分別采集19個水稻品種的葉片，由中玉金標記（北京）生物技術股份有限公司提取基因組DNA，用引物組進行PCR擴增并檢測，確定各水稻品種分子標記位點的基因型。待成熟后按照1.2中所述方法檢測其籽粒鎘含量，評估分子標記鑒定結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 水稻籽粒鎘積累關聯SNP位點的鑒定

實驗室前期對水稻微核心種質材料的籽粒鎘含量進行全基因組關聯分析，從中定位到12個QTL并鑒定到1個籽粒鎘轉運相關基因OsCd38[9]。OsCd38基因序列上共有35個SNP位點，對這些SNP位點進行連鎖不平衡分析（圖1），共篩選出6個標簽SNP位點。對6個SNP位點的不同等位基因型對應的籽粒鎘含量進行顯著性差異分析，結果（圖1）顯示，SNP6位點不同等位基因型對應的籽粒鎘含量之間存在顯著性差異。SNP6位于日本晴10號染色體上第20 089 955位，其核苷酸為C或T。65個水稻品種中，18個水稻品種的TagSNP-20089955位點基因型為TT，籽粒鎘含量平均值為0.143 mg·kg-1；47個水稻品種的TagSNP-20089955位點基因型為CC，籽粒鎘含量平均值為0.423 mg·kg-1（表2）。結果表明，TagSNP-20089955位點核苷酸種類為T的品種水稻籽粒鎘含量均值顯著低于該位點為C的水稻品種均值，該位點的等位變異可有效鑒別不同基因型水稻品種的籽粒鎘積累特性，可作為功能性SNP位點。

圖1 TagSNP-20089955的篩選與基因分型Fig.1 Screening and genotyping of TagSNP-20089955

表2 不同基因型水稻種質材料的籽粒鎘含量Table 2 Grain Cd content and genotypes of different genotype rice

2.2 LCd-38分子標記的開發與基因分型

根據設計的KASP引物，從65份水稻微核心種質資源材料中選取10個水稻品種，其中5個品種為TT基因型，5個品種為CC基因型，利用LCd-38進行鑒定。結果（圖2）顯示，5個品種的信號點為藍色，5’末端連接FAM熒光標簽序列的引物競爭性擴增，表明其基因型為TT；5個品種的信號點為紅色，5’末端連接HEX熒光標簽序列的引物競爭性擴增，表明其基因型為CC；陰性對照NTC（no template control）不產生熒光信號。LCd-38對10個微核心水稻品種基因型鑒定結果與實驗室前期測序結果一致，表明LCd-38標記開發成功。

圖2 LCd-38分子標記對不同基因型水稻種質材料的KASP分型Fig.2 KASP genotyping of different genotypes by LCd-38

2.3 LCd-38分子標記的驗證

根據開發設計的KASP引物，選取另外20份微核心種質庫水稻材料進行基因型分型，以20份微核心水稻品種的籽粒鎘含量平均值0.322 mg·kg-1為標準。結果（圖3）顯示，LCd-38標記位點可以準確地聚類相同基因型的種質材料，各信號點的熒光信號值較高。陰性對照NTC單獨聚集在一起，不產生熒光信號。利用基因型對材料進行分類，與籽粒鎘含量測定結果進行比對，其中7個水稻材料為低鎘基因型TT（藍色點），籽粒鎘含量平均值為0.134 mg·kg-1，所有水稻品種籽粒鎘含量均低于0.322 mg·kg-1；2個水稻材料為雜合基因型（綠色點），籽粒鎘含量平均值為0.436 mg·kg-1；11個水稻材料為高鎘基因型CC（紅色點），籽粒鎘含量平均值為0.421 mg·kg-1，所有水稻品種籽粒鎘含量均高于0.322 mg·kg-1（表3）。結果表明，該標記能夠有效區分2種純合基因型，且能夠鑒別出雜合基因型，具有共顯性特點。此外，KASP基因型讀取時按照樣品顏色來鑒定基因型，更為方便高效[29]。

圖3 LCd-38分子標記對水稻種質材料籽粒鎘含量預測結果Fig.3 Results of LCd-38 markers on the grain Cd concentration of rice germplasm

2.4 利用LCd-38標記篩選鎘低積累水稻品種

2.4.1 試驗地區主栽品種基因型與籽粒鎘含量分析 為了篩選適合試驗地區種植的鎘低積累水稻品種，利用LCd-38對當地主栽品種進行基因分型。結果（圖4）顯示，5個水稻品種的LCd-38分子標記位點為低鎘積累基因型TT，分別為嘉67、秀水121、紹糯9714、秀水14和嘉58；9個水稻品種的分子標記位點為雜合基因型CT；5個水稻品種的分子標記位點為高鎘積累基因型CC，分別為嘉5-258、甬優17、甬優217、泰兩優217和嘉禾218。

以全部待篩選水稻品種的籽粒鎘含量平均值0.312 mg·kg-1為標準，結合水稻品種的籽粒鎘含量與基因分型結果（表4）進行分析。結果表明，9個基因型為CT的水稻品種籽粒鎘含量范圍為0.021～0.786 mg·kg-1，變異系數達 98.66%，其中 7個水稻品種籽粒鎘含量低于0.312 mg·kg-1，2個品種籽粒鎘含量高于0.312 mg·kg-1；5個基因型為TT的水稻品種籽粒鎘含量均值為0.048 mg·kg-1，均穩定低于0.312 mg·kg-1；5個基因型為CC的水稻品種籽粒鎘含量均值為0.672 mg·kg-1，均穩定高于0.312 mg·kg-1。

表4 試驗區不同基因型水稻品種籽粒鎘含量Table 4 Grain Cd content and genotypes of different genotype rice in experimental area

2.4.2 試驗地區適種的鎘低積累水稻品種篩選以《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[30]中規定的水稻籽粒鎘限量值0.200 mg·kg-1為標準，5個基因型為TT的水稻品種籽粒鎘含量最小值為0.017 mg·kg-1，最大值為0.066 mg·kg-1，均低于0.200 mg·kg-1；9個基因型為CT的水稻品種呈現出超標與不超標兩種情況；5個基因型為CC的水稻品種籽粒鎘含量范圍為0.265～1.059 mg·kg-1，均高于 0.200 mg·kg-1。

試驗區19個水稻品種中，SNP分子標記位點核苷酸種類為TT的品種水稻籽粒鎘含量均值顯著低于該位點為CC水稻品種籽粒鎘含量均值（圖4）。100%的基因型為TT的水稻品種中籽粒鎘含量未超過0.312 mg·kg-1，也未超過國家食品安全標準限量值0.200 mg·kg-1，100%的基因型CC的水稻品種籽粒鎘含量均高于標準0.312 mg·kg-1，也高于國家食品安全標準限量值0.200 mg·kg-1。因此，嘉67、秀水121、紹糯9714、秀水14和嘉58適合在富陽區安全利用類土壤種植；嘉5-258、甬優217、甬優17、泰兩優217和嘉禾218為鎘高積累水稻品種，需謹慎種植；雜合基因型的水稻品種的籽粒鎘積累特性介于高低積累特性之間，該標記不適合位點為雜合基因型的水稻品種籽粒鎘積累特性鑒定。

圖4 試驗地主栽水稻品種的KASP基因分型和籽粒鎘含量Fig.4 KASP genotyping and grain Cd content of 19 rice varieties in experimental area

3 討論

水稻是我國三大主糧作物之一，稻米鎘超標問題威脅居民食品安全。選育鎘低積累水稻品種可有效降低稻米鎘污染風險。在常規篩選中，水稻籽粒鎘積累表型易受稻田土壤環境、水肥管理措施、氣候變化等外界環境因素的影響而不穩定，且由小范圍試驗到大田推廣所需的時間長，因此不能滿足穩定高效的篩選需求。分子標記輔助選育是利用與籽粒鎘積累性狀緊密連鎖的基因設計分子標記來進行基因型篩選，再結合常規育種方法培育新品種的技術，具有高效準確且不受環境干擾的優點。

本研究基于籽粒鎘積累轉運基因鑒定到功能性SNP位點TagSNP-20089955，該位點核苷酸種類為T的水稻品種籽粒鎘含量均值顯著低于該位點為C的水稻品種籽粒鎘含量均值。根據其基因分型設計了KASP分子標記LCd-38用于鎘低積累水稻品種的選育。與前代分子標記相比，KASP技術具有操作簡便、結果準確、成本較低的優點，只需以葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增即可，在SNP位點基因型的鑒定上已得到廣泛應用。驗證結果顯示，KASP分子標記LCd-38可以準確地聚類相同基因型的材料。

浙江省杭州市富陽區稻田土壤鎘含量平均值高于浙江省與中國土壤鎘含量背景值，高風險區域主要集中在城鎮和工礦企業周邊農田[31-33]；部分水稻籽粒鎘含量超過了《食品安全國家標準食品中污染物限量》中規定的0.200 mg·kg-1[33-34]。本研究選取富陽區安全利用類稻田為試驗地，篩選適合當地種植的鎘低積累水稻品種以降低籽粒鎘污染風險。利用分子標記LCd-38對當地主栽品種進行基因分型的結果表明，該標記可精確地將不同水稻品種分為高鎘基因型（CC）和低鎘基因型（TT）。篩選到的5個低鎘基因型水稻品種籽粒鎘含量均未超過0.200 mg·kg-1，符合食品安全國家標準限量值，在試驗區土壤鎘污染條件下，可被列為鎘低積累水稻品種，該示例對于鎘低積累水稻材料的創制也具有參考價值。

水稻籽粒鎘積累性狀是多基因控制的數量性狀，其中有主效基因，也有微效基因，單一考慮某個基因的SNP位點無法實現對所有水稻品種籽粒鎘積累特性的準確預測。基因型位點為雜合型的水稻品種籽粒鎘含量變異系數大，目前開發的分子標記只能針對純合基因型水稻品種進行預測，無法準確鑒定雜合基因型水稻品種的籽粒鎘積累特性，未來仍有待于開發更多的分子標記，通過多標記聯合檢測體系以實現不同基因型水稻品種鎘積累特性的精準鑒定。