不同形貌納米氫氧化鎂對芒果葉斑病原真菌的抑制作用

張頂洋， 邱賽飛， 饒文華， 郭雪萍， 曹芳， 翟天鋆， 關雄， 潘曉鴻

（福建農林大學植物保護學院，閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室，生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室，福州 350002）

芒果（Mangifera indica Linn）不僅風味獨特，而且營養價值較高，是我國重要的熱帶種植水果之一[1]。真菌病害是芒果生產中極為重要的限制條件[2]，已報道的芒果真菌病害多達80多種[3]，其中最常見的為芒果炭疽病、白粉病、葉斑病、流膠病等[4]，又以芒果葉斑病發生較普遍、危害性較大，且寄主范圍較廣。當前農業生產中，防治芒果病害仍以高效、快速的化學藥劑為主[5]，但化學藥劑對環境及芒果的產量和品質都會產生不良影響，因此，開展綠色防控對促進我國芒果產業優質、健康發展具有重要意義[6]。

納米材料具有表面和界面效應、量子尺寸效應、小尺寸效應及宏觀效應等超常特性，因而受到了廣泛的關注[7-9]。目前，納米材料已被應用于環境能源、航空航天、生物醫藥等多個領域。納米技術極大地促進了農藥的可持續發展，2019年，國際純粹與應用化學聯合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）將納米農藥評為未來改變世界的化學領域十大新興技術之首[10]。研究表明，納米材料可以作為新型的殺菌劑，且其與傳統無機抗菌劑相比，具有更優良的抗菌效果[11-12]。Diem等[13]研究表明，納米銀和納米金對水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）和水稻稻瘟菌（Pyricularia oryzae Cav.）具有較好的抑菌活性。蒲麗等[14]報道，納米二氧化鈦對煙草青枯菌（Pseudomonas solanacearum）的抑制率可達90%以上。但是這些納米材料都存在一定的生物毒性且價格昂貴。因此，研發健康、廉價的新型抗菌材料具有重要意義。納米氫氧化鎂是一種新型無機材料，由于其具有低成本、環境友好等特點，已被廣泛應用于重金屬吸附、廢水處理和阻燃劑等領域[15]。此前，鄭軍[15]系統地研究了納米氫氧化鎂的廣譜抗菌性能，發現納米氫氧化鎂對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等都具有顯著的抗菌活性；Dong等[16-17]發現納米氫氧化鎂懸浮液對大腸桿菌具有抑菌效果；陳蓉等[18]研究了納米氫氧化鎂對茶葉黑斑病原菌的抗菌活性。上述結果表明納米氫氧化鎂是一種優良的抗菌材料。然而，在組成成分相同的情況下，不同尺寸、形貌、聚集狀態和表面電荷的納米材料表現出不同的抑菌活性。劉慧穎等[19]研究了氧化鋅微/納米顆粒對食源性致病菌的抑制效果，發現棒狀和梭狀氧化鋅的抑菌效果優于空心球狀和蜂窩狀氧化鋅的抑菌效果，而相同形貌的氧化鋅，顆粒尺寸越小的抑菌活性越大。王俊怡等[20]利用水熱法制備的不同形貌氧化鎂（球狀、塊狀）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都表現出不同的抗菌性能。因而，為了選擇適當的納米氫氧化鎂作為抗菌劑，需對不同形貌、尺寸的納米氫氧化鎂抑菌活性進行評估。

本研究從芒果危害部位分離病菌，經形態特征與分子鑒定結果確定分離的菌株為芒果擬莖點霉葉斑病病原菌，制備了3種不同形貌的納米氫氧化鎂，比較了不同納米氫氧化鎂對芒果葉斑病病原菌的抑制活性，以期為高效環保納米氫氧化鎂抗真菌制劑的研制提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 芒果葉斑病病葉樣品采自福 建 農 林 大 學 倉 山 校 區（N26°05′9.35″，E119°14′0.57″）芒果樹。

1.1.2 實驗試劑 葡糖糖、瓊脂粉、輕質氧化鎂（MgO）、MgCl2·6H2O、NaOH均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 PDA固體培養基 200 g馬鈴薯切碎，加蒸餾水煮沸，搗成泥狀，經紗布過濾，收集濾液。在濾液中加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌，備用[21]。

1.2 方法

1.2.1 病菌的分離和培養 將病葉表面清洗消毒后，于病健交界處切取5 mm×2 mm葉片，經無菌水清洗，使用75%的酒精表面消毒，使用1 g·L-1氯化汞再次消毒5 min，無菌水沖洗3～5次后控干水分[22]。將處理后的組織樣本以環形方式排列于培養皿，每皿放置3～4片，28℃恒溫培養3～5 d。待長滿菌絲后，于菌絲邊緣處用滅菌的槍頭打孔，置于新的培養皿中央進行培養，重復以上操作3次后得到純化菌株，并將其置于4℃冰箱保存，命名為FAFU20190827。

1.2.2 病原菌的形態學鑒定 將供試菌株接種到PDA培養基上，于28℃條件下培養6～8 d，產孢后挑取病原菌經制片、壓片，在光學顯微鏡下觀察菌絲大小、結構與形狀，并根據菌落的生長特征（顏色、大小等）初步確定其屬和種[22-23]。

1.2.3 ITS序列分析 使用CTAB法提取病原真菌DNA，操作方法參照全式金DNA抽提試劑盒。以DNA為模板，利用真菌核糖體基因轉錄間隔區通 用 引 物 ITS1（5’-TCCGAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對病原菌ITS區域進行PCR擴增。PCR反應體系[25]：ddH2O 9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，DNA 模板 1 μL。擴增條件：95℃預變性3 min；94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸60 s，35個循環；72℃延伸10 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段回收后送福州鉑尚生物技術有限公司測序。

將獲得的序列在GenBank數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行 BLAST 比對，尋找近似的真菌種系，采用NJ法構建菌株系統進化樹，最終確定其種類。

1.2.4 納米氫氧化鎂制備 ①MHNPs-MgO600制備[26]：2 g MgO在馬弗爐中600℃加熱2 h，取出后迅速加入到快速攪拌的500 mL ddH2O中，室溫攪拌過夜。②MHNPs-MgO80制備[27]：將2 g MgO加入80℃純水中攪拌24 h。③MHNPs-MgCl2的制備[18]：7 g MgCl2·6H2O加 10 mL ddH2O 攪拌溶解，2.76 g NaOH加10 mL ddH2O攪拌溶解，將NaOH溶液緩慢加入MgCl2·6H2O溶液，攪拌過夜。

所有樣品均經10 000 r·min-1離心收集，使用ddH2O洗滌3次，得到的產物80℃烘干并研磨。

1.2.5 納米氫氧化鎂表征 使用X-射線衍射分析（XRD，PANalytical X’Pert PRO，40 kV，40 mA）和掃描電鏡（SEM，JSM-6700F，FEI Co.，USA）對納米氫氧化鎂的尺寸和形貌進行分析和觀察，借助Jade6.5分析XRD 數據，由謝樂（Scherrer）公式（式1）計算合成的納米顆粒在（101）面的尺寸。

式中，D為晶粒垂直于晶面方向的平均厚度，K為Scherrer常數，B為樣品衍射峰半峰高寬度，θ為布拉格角，λ為X射線波長，為1.54?。

1.2.6 抑菌實驗 使用平板涂布法評估納米氫氧化鎂的抑菌效果。分別配制質量濃度為5、25和50 mg·mL-1（分別為T1、T2、T3）的不同形貌納米氫氧化鎂的懸濁液，涂布前用超聲清洗儀30℃超聲30 min，作為樣品備用。在PDA培養基中加入50 μL納米氫氧化鎂懸浮液，并在培養基表面均勻涂布，自然晾干后，將直徑為8 mm的真菌菌餅接至培養基中央。同時以加入等量無菌水的PDA平板作為空白對照（CK），每組設置3個重復。28℃恒溫培養，采用十字交叉法分別測量3、4和5 d的菌落直徑，設置3次重復，計算菌絲生長抑制率[27]。采用SPSS v26進行單因素方差ANOVA分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌株的生物學表征

2.1.1 病原菌形態學特征 從圖1可以看出，分離的病原菌菌絲初為乳白色、表面平坦，經過一段時間后菌絲呈絲絨狀，平鋪生長，可見其具有環狀白色同心紋，菌絲密集且中央區域趨于暗黃偏褐。在顯微鏡下觀察芒果葉斑病病原菌菌絲分枝，壁薄，呈暗褐色，有膈膜縊縮現象，經常纏繞形成菌絲環，未見產孢結構。

圖1 病原菌形態Fig.1 Morphology of pathogen

2.1.2 病原菌的分子生物學鑒定 將ITS擴增片段測序結果與GenBank數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的序列進行比對，從比對結果中選擇種屬較近的菌株序列，以NJ法構建系統進化樹，結果顯示，菌株FAFU20190827在進化樹上歸屬于間座殼屬（Diaporthe musigena）（圖2）。

圖2 基于ITS序列的NJ-系統發育樹Fig.2 NJ-system phylogenetic tree based on ITS sequence

2.2 納米氫氧化鎂的表征

2.2.1 納米氫氧化鎂的形貌比較 采用XRD及SEM分析納米氫氧化鎂的尺寸和形貌。結果（圖3）表明，不同方法合成的3種納米氫氧化鎂樣品與標準數據庫卡片（JCPDF-044-1482）的特征峰一致。SEM結果表明，合成的納米氫氧化鎂呈現不同的形貌，且較易團聚成微粒。在600℃下，通過水熱法合成的納米氫氧化鎂形貌為薄片狀（圖3A），在80℃下合成的為花瓣狀（圖3B），而通過化學沉淀法合成的納米氫氧化鎂形貌為六邊形（圖3C）。根據謝樂公式求得3種納米氫氧化鎂在(101)面的尺寸分別為60.50、13.53和11.62 nm。

圖3 不同方法制備的納米氫氧化鎂的XRD和SEM圖Fig.3 XRD and SEM images of nano-Mg（OH）2prepared by different methods

2.2.2 納米氫氧化鎂比表面積和Zeta電位 從圖4可以看出，MHNPs-MgO600、MHNPs-MgO80和MHNPs-MgCl2樣品的比表面積分別為（14.88±0.10）（92.61±0.52）和（77.42±0.64）m2·g-1，這表明，以氧化鎂作為原料合成氫氧化鎂時，600℃的高溫不利于納米氫氧化鎂的孔隙形成，使得其比表面積遠小于在80℃下合成的氫氧化鎂，而選用氯化鎂為原料合成的納米氫氧化鎂的比表面積略小于利用氧化鎂在80℃下合成的氫氧化鎂。因此，不同的合成原料和溫度都會對納米氫氧化鎂的比表面積產生影響。3種納米氫氧化鎂的表面Zeta電位分別為（47.28±1.89）（26.65±1.64）和（32.15±1.25）mV，MHNPs-MgO80具有最低的表面電荷，在水溶液中的穩定性低于另外2種納米氫氧化鎂。不同合成方法制備的納米氫氧化鎂在形貌、尺寸和表面積等物理化學性質上都存在較大的差異[28]，且不同方法合成納米氫氧化鎂的抗菌活性也與其理化性質直接相關[26]。

圖4 不同方法制備的納米氫氧化鎂的比表面積和Zeta電位Fig.4 BET surface area and Zeta potential of nano-Mg（OH）2prepared by different methods

2.3 不同納米氫氧化鎂對芒果葉斑病原真菌的抑菌效果

從圖5可以看出，加入納米氫氧化鎂的平板上病菌生長直徑明顯減小，說明3種納米氫氧化鎂對芒果葉斑病原真菌的生長均具有較好的抑制作用，抑菌作用由高到低依次為：MHNPs-MgO80＞MHNPs-MgO600＞MHNPs-MgCl2，且納米氫氧化鎂的質量濃度越大，抑菌效果越明顯。

圖5 納米氫氧化氫處理后芒果葉斑病原菌生長情況Fig.5 Pathogen growth of mango phoma leaf spot treated with different nano-Mg（OH）2

25 mg·mL-1的3種納米氫氧化鎂對菌絲生長抑制率都在40%以上，而MHNPs-MgO80在50 mg·mL-1時菌絲生長抑制率可達71.11%（表 1）。抗菌實驗結果表明，3種納米氫氧化鎂的抗菌效果存在較大的差異，這可能和上述理化性質等直接相關。

表1 不同質量濃度的納米氫氧化鎂對芒果葉斑病原菌的抑菌率Table 1 Inhibition rate of pathogen of mango phoma leaf spot at different concentrations for three nano-Mg（OH）2

3 討論

使用化學殺菌劑防治植物病害是保證農作物高產、穩產的重要措施之一，但是病原菌很容易對化學殺菌劑產生抗性，最終導致化學防治失敗[29]。相對于有機和天然類抗菌劑而言，無機納米材料具有毒性低、對環境生態和人類健康危害小且熱穩定性較高以及病原菌不容易產生抗性等優點[26-27]。納米氫氧化鎂具有持久和廣譜的抗菌活性，是一種安全無毒、環境友好、應用潛力巨大的抗菌材料[15]。相對于其他納米材料，納米氫氧化鎂的來源簡單且成本低。目前，關于納米氫氧化鎂抑菌性能的研究主要評估單一形貌的納米氫氧化鎂對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等模式病原菌的抑菌活性，但分析納米氫氧化鎂對水果病害的抑菌活性差異，以及形貌和尺寸對其抑菌活性影響的研究卻鮮有報道。

本研究從芒果葉片中分離得到病原真菌，經形態和分子鑒定確認其為芒果莖點霉葉斑病病原菌，該病原菌主要危害葉片，使葉片產生斑點、干枯，影響芒果的光合作用。芒果葉斑病作為芒果生產中比較普遍的一種病害，對我國芒果的產量和品質都產生了巨大的影響。本研究合成制備的3種納米氫氧化鎂對芒果葉斑病原真菌都具有良好的抑菌活性，且質量濃度越高，抑菌活性越強，其抑菌活性大小表現為MHNPs-MgO80＞MHNPs-MgO600＞MHNPs-MgCl2，這與 3種納米氫氧化鎂的比表面積大小趨勢一致，表明比表面積是影響納米氫氧化鎂抑菌活性的因素之一。此外，通過Zeta電位結果，推測3種納米氫氧化鎂顆粒對芒果葉斑病原真菌具有不同的抑菌性能的原因可能是它們具有不同的表面電荷，與病原菌表面的吸附能力存在差異，而在電荷的相互作用下被吸引在病原菌表面的納米顆粒能破壞病原菌細胞壁的完整性并且增加細胞膜的通透性，最終導致病原菌的死亡。真菌的電位一般為負電，MHNPs-MgO80具有較小的表面電荷和最大的比表面積，更易于與病原菌接觸，因而MHNPs-MgO80的抑菌效果更好。研究表明，納米材料抗菌機理主要有活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生、金屬離子溶出和接觸滅菌等[12]，同時納米氫氧化鎂可以通過接觸破壞細胞膜，導致內容物流出和通過胞吞作用進入細胞內，在細胞內釋放大量OH-，使菌體的DNA和蛋白質損傷變性，從而導致菌體死亡[16-17]。但本研究尚未對納米氫氧化鎂對芒果葉斑病病原真菌的抑菌機制進行研究，還有待深入探索。

本研究制備的3種不同形貌的納米氫氧化鎂對芒果葉斑病病原真菌均具有顯著的抑制效果，其抗菌效果的差異與其自身的電荷、比表面積等理化性質以及抗菌劑的質量濃度相關。不同方法合成的納米氫氧化鎂雖然對病原真菌都具有一定的抗菌性，但它們的抗菌性能存在較大的差異，這說明在選擇高效納米抗菌劑時應考慮其合成方法、理化性質等對抗菌效果的影響。本研究為篩選合適的納米抗真菌制劑提供了新的研究思路，也為納米材料在農業病原菌的防治提供理論指導。今后可考慮將納米氫氧化鎂顆粒作為一種抗菌材料應用于果樹病害的綠色防控，一方面能減少傳統化學農藥的使用，提高我國水果產業的品質和產量，另一方面能降低對環境的影響，保障人們的健康生活。