板栗黃化皺縮病的病原菌鑒定及其防治

楊文杰， 溫曉蕾， 馮麗娜， 張娜娜， 孫偉明， 齊慧霞

（河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北 秦皇島 066000）

板栗（Castanea mollissima），又名栗、栗子、風臘，是殼斗科栗屬植物[1]。燕山板栗具有香、甜、糯的獨特風味，主要分布在燕山山脈的河北和北京轄區內。河北省唐山市遷西縣的板栗有“東方珍珠”的美譽，板栗產業已成為遷西縣栗農的“綠色銀行”，其穩定、健康的發展對河北省經濟發展具有重要促進作用[2]。

近年來，我國冀東和冀北板栗主產區發生了一種病害，其典型癥狀為成熟期葉片皺縮并褪綠黃化、栗蓬個體小且不易成熟，成熟后栗果干癟且表面粗糙、失去商品性狀，發病嚴重時整株衰亡。這些癥狀與20世紀90年代北京懷柔區報道的板栗黃化皺縮病(Chinese chestnut yellow crinkle，CnYC)[3]十分相似。當地農民認為病害是由于“缺素”或者病毒造成的，俗稱“板栗小葉病”。然而，各地按照“缺素癥”進行防治均未取得顯著效果[4]。根據近年的調查發現，很多發病嚴重的板栗樹由于不可治愈的“病毒病”而不得不被砍伐。

由于這種癥狀類似板栗黃化皺縮病的病原菌尚未明確，一旦發生爆發沒有有效的防治手段，將導致板栗大量減產，嚴重威脅板栗產業的健康發展。因此，本文以冀東和冀北板栗主產區為研究區域，利用分子生物學和形態學相結合的方法，鑒定該病的病原菌并明確其分類地位，通過田間試驗來篩選有效的防治藥劑，并結合修剪整形、肥水管理、刺吸式防治等綜合防控技術，從而為冀東和冀北地區板栗黃化皺縮病的綜合防控提供科學的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 所用試劑

PCR擴增和片段回收試劑購自TaKaRa公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。鹽酸四環素（100 g·袋-1）、土霉素（1 kg·桶-1）、多肽四環素（100 g·袋-1）、羅紅霉素（1 kg·桶-1）、氯霉素（1 kg·桶-1）、氟苯尼考（1 kg·桶-1）和井岡霉素（1 kg·桶-1）均購自河北制藥股份有限公司。

1.2 田間病害調查及樣品采集

在板栗萌芽期、展葉期、花期、成熟期和落葉前期從冀東地區板栗小葉病發生的3個自然村（河北省唐山市遷西縣楊家峪、尖山峪、上洪寨）和河北省秦皇島市1個未發病自然村（茨榆山）采集發病與健康板栗植株的葉片和枝條，低溫運送至實驗室。分別切取發病與健康的葉片和枝條韌皮部（2～4 mm2），一部分用2.5%戊二醛固定，用于組織學觀察；剩余部分-70℃保存，用于病原菌的分子生物學檢測。

1.3 16S rDNA的克隆

用植物基因組DNA提取試劑盒（天根）試劑盒提取葉片基因組DNA。以病害葉片基因組DNA為模板，利用R16 mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2引物進行16S rDNA巢式PCR擴增[5]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收和純化目的片段。0.5 μL pMD 19-T載體和4.5 μL回收PCR產物，16 ℃連接16 h，轉化感受態細胞E.coli DH5α[6]。通過PCR檢測獲得的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

利用DNAMAN 5.0完成序列拼接，去除載體后，在NCBI數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Blastn比對。選取高度相似的序列，使用MEGA 5.0鄰近法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。利用在線分析軟件iPhyclassifier進行16S rDNA基因的虛擬RFLP分析，明確板栗黃化皺縮病病原菌植原體的分類地位。

1.4 病害組織觀察

將固定好的分子檢測呈陽性的樣品含韌皮部組織通過30%、50%、70%、85%、95%、100%酒精脫水，每次1～2 h，用丙酮置換乙醇，再通過Spurr樹脂浸透、包埋，制作超薄切片，在透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察病害組織結構。

1.5 不同生長期發病組織內植原體的檢測

基于植原體16S rDNA，利用巢式PCR[5]檢測板栗不同生長期發病葉片和枝條韌皮部植原體，計算檢出率。

1.6 田間防治藥劑篩選

在唐山市遷西縣上洪寨地區，于10月采用樹干打孔吊袋輸液的方式進行注藥處理：鹽酸四環素和多肽四環素質量濃度均為10.0 g·L-1，羅紅霉素、土霉素、氯霉素、氟苯尼考和井岡霉素質量濃度均為8.0 g·L-1，選擇樹齡在20～35年的發病板栗植株作為防治對象，每株注藥500 mL。于板栗采收前10 d進行病害調查，記錄板栗黃化皺縮病整株水平上的分級標準。0級：無病；1級：發病葉片占總葉片的1/4以下;2級：發病葉片占總葉片的1/4～1/2；3級：發病葉片占總葉片的1/2～3/4；4級：發病葉片占總葉片的3/4以上；5級：所有葉片全發病。同時測定葉片和栗蓬大小，采收后測定栗仁重、百果重及商品性狀。計算病情指數、防治效果、單果重。每個處理3次重復，每個重復調查3棵樹。

1.7 綜合防控措施

在秋季收獲后落葉前，用10 g·L-1鹽酸四環素打孔吊袋輸液(5＜主干直徑≤10 cm，用藥150～300 mL；10＜主干直徑≤20 cm，用藥300～600 mL；20＜主干直徑≤40 cm，用藥600～1 000 mL)殺滅板栗植原體；在春季展葉期，葉面噴施蕓苔素內酯以及低質量濃度磷酸二氫鉀和微量元素混合成的葉面肥，緩解滴注鹽酸四環素導致的暫時藥害，促進枝葉健康生長。對板栗黃化皺縮病發病嚴重的郁閉樹進行“去腐生肌”修剪，保留主干，疏除發病的過高、過粗、過密多年生且通過輸液藥液無法或不易到達的1～2個主枝(大枝或枝組)，其他小枝少修剪或者不修剪，遵循原則為“多病枝，剪主枝”。當年沒有治愈的病樹，于秋季收獲后落葉前，利用2.5 g·L-1鹽酸四環素打孔吊袋輸液進行第2次藥劑防治，并遵循“小病枝，剪大枝”原則進行修剪，保留健康主枝，剪除存在小病枝的2～3個大枝(直立枝、重疊枝、交叉枝等)，避免病害復發。綜合防控試驗示范面積為0.67 hm2。于板栗采收前，采用5點取樣法對示范基地進行抽樣檢測，每點2個單株，調查整株發病情況以及飽果和癟果栗蓬數，計算病情指數、防治效果和飽果率。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

發病植株在萌芽前，病狀主要表現在2年生枝條上，枝條皮孔明顯粗大。板栗萌芽到展葉期，幼嫩枝梢的頂部葉片表現為嫩梢頂端葉片小、發黃且皺縮。隨著板栗生長和開花，主要表現為葉片皺縮、畸形且褪綠等癥狀。長出栗蓬后，枝梢頂端和下部的葉片出現黃化、皺縮和褪綠等癥狀，甚至出現空蓬現象。在采收前出現典型的葉片下卷、皺縮、褪綠黃化等癥狀。發病板栗植株存在果實成熟晚的特點，板栗果干癟且表面粗糙。

2.2 病原菌的分子鑒定

病原菌16S rDNA擴增片段大小為1 247 bp，提交到GenBank，登錄號為MW264918。對比結果顯示，冀東與冀北地區板栗黃化皺縮病病原菌與北京懷柔區發現的板栗植原體Candidatus Phytoplasma castaneae CnYC（EU599362）和韓國板栗植原體Ca.P.castaneae（AB054986）的相似度分別為99.4%和99.6%。基于16S rDNA序列的系統發育樹結果（圖1）顯示：板栗黃化皺縮病病原菌與北京懷柔區和韓國的板栗植原體聚在同一支，這表明本研究的板栗黃化皺縮病病原菌為Ca.P.castaneae，菌株命名為 CnYC-Hebei。

圖1 基于16S rDNA序列系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

計算機虛擬RFLP分析（圖2）表明，Ca.P.castaneae CnYC-Hebei的16S rDNA序列與16SrXIX-A亞組的北京懷柔區板栗植原體（EU599362）和韓國板栗植原體（AB054986）圖譜一致，相似系數為1.00（表1），與其所屬亞組現有株系RFLP圖譜的相似系數＞0.97，表明Ca.P.castaneae CnYC-Hebei屬于16SrXIX-A亞組。

表1 16S rDNA F2n/R2區段計算機虛擬的RFLP相似系數Table 1 RFLP similarity coefficient of 16S rDNA F2n/R2 region computer simulation

圖2 16S rDNA F2n/R2區段計算機虛擬的RFLP圖譜Fig.2 RFLP map of 16S rDNA F2n/R2 region computer simulation

2.3 病原菌的形態特征

將待測樣品制作成樹脂切片，通過透射電子顯微鏡進行觀察，在發病植株葉片和枝條韌皮部中發現近圓形的無細胞壁但具單位膜的結構，細胞大小約為0.1～0.7 μm（圖3）。該結構與植原體相似，而健康樣品中未發現，進一步表明板栗黃化皺縮病病原為植原體。

圖3 發病組織的透射電子顯微鏡觀察Fig.3 Observation of the diseased tissues by TEM

2.4 板栗不同生長期發病組織病原菌檢出率的變化規律

通過巢式PCR檢測板栗不同生長期發病組織內植原體變化規律，結果如表2所示。發病葉片在花期、成熟期和落葉前期的病原菌檢出率分別為20.0%、47.5%和66.3%，而萌芽期和展葉期未能檢出；發病枝條在成熟期和落葉前期的檢出率分別為33.2%和52.3%，在萌芽期未檢測出植原體。這表明在發病葉片和枝條各時期的檢出率均隨著病癥的顯現而增高，且發病葉片檢出率高于枝條。因此，利用巢式PCR技術檢測發病樣品的最佳采樣時期應為成熟期和落葉前期。

表2 發病植株的植原體檢出率Table 2 Detection rate of Ca.P.castaneae in diseased plant （%）

2.5 CnYC的田間防治藥劑篩選

在板栗生長期后期及成熟期，分別對病情指數、栗蓬大小、飽果率及單果重進行了調查分析，其結果如表3所示：鹽酸四環素的防治效果最好，其病情指數為13.3，防治效果達到85.0%，并且栗蓬大小為39.4 mm×35.1 mm、葉片大小為15.4 mm×6.8 cm、飽果率為88.0%、單果重為7.4 g，均顯著高于對照；其次為多肽四環素、羅紅霉素，其病情指數均為33.3，防效均為62.4%，栗蓬大小分別為42.4 mm×36.6 mm、40.5 mm×35.3 mm，飽果率為97.7%、84.3%，單果重為 7.2、7.1 g，均顯著高于對照。

表3 農用抗生素藥劑處理后防治效果及栽培性狀Table 3 Control effects and cultivation characters with agricultural antibiotics

2.6 CnYC的綜合防控效果

綜合防治處理組的病情指數僅為12.0，而未防控對照組（CK）的病情指數高達88.0，綜合防治效果達到86.4%，單果重、飽果率、栗蓬大小和葉片大小分別為8.1 g、91.9%、48.5 mm×42.0 mm和18.1 cm×7.5 cm，均顯著優于對照組。該綜合防控技術能有效地改善樹勢，使板栗葉片光滑平整、顏色深綠、大小均一，枝條舒展，栗蓬多而飽滿、適時開裂，板栗殼光滑有光澤，栗仁飽滿，這表明利用該套綜合防控技術能有效地控制該病害。

表4 綜合防治處理后防治效果及栽培性狀Table 4 Control effects and cultivation characteristic with integrated control

3 討論

植物植原體的分類鑒定通常利用分子生物學和組織學相結合的方法來完成[7]。常用于植原體分類的主要有核糖體蛋白基因（rp）、延伸因子（tuf）、轉運蛋白（secY）、外膜蛋白（OMP）等基因以及16S rDNA序列、16S-23S rRNA間隔區序列[8]。對于植原體病害的分子鑒定一般需要利用特異引物從病害組織中擴增克隆至少2種分類基因來進行分類鑒定。組織學特征主要是通過熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察發病植株的幼嫩組織來確定植原體的存在部位以及形態和大小。2003年，Jung等[9-10]基于16S rDNA基因，利用巢式PCR擴增檢測板栗叢枝病（Chestnut witches’broom）病原菌，確定植原體Ca.P.castaneae為板栗叢枝病的病原菌。2011年，林彩麗等[11]基于16S rDNA基因利用巢式PCR擴增和透射電子顯微鏡研究了北京懷柔區發生的板栗黃化皺縮病（CnYC）病原菌，結果表明，北京懷柔區板栗黃化皺縮病的病原菌為植原體Ca.P.castaneae，與韓國板栗Ca.P.castaneae同屬于 16SrXIX-A 組[3，11]。本研究也基于16S rDNA進行分子生物學鑒定，并結合透射電子顯微鏡組織學觀察相結合的方法確定冀東與冀北地區板栗黃化皺縮病病原菌為Ca.P.castaneaeCnYC-Hebei，與韓國和北京懷柔區板栗植原體屬于16SrXIX-A組，板栗植原體16S rDNA序列在成熟期和落葉前期發病葉片內的檢出率較高，分別為47.52%和66.27%。目前，除16S rDNA基因外，還沒有報道過板栗植原體Ca.P.castaneae的其他分類鑒定基因。

棗瘋病、甘薯黃龍病、柳樹叢枝病、泡桐叢枝病等果樹植原體病害的防控方法措施主要有選育抗病品種、滴注四環素類抗生素藥物、環剝主干和殺滅刺吸式昆蟲等[12-17]。趙進紅等[18]于4月份采用樹干注射法對不同藥物的防治效果進行研究，發現四環素、土霉素、螺旋霉素和紅霉素均能在一定程度上控制棗瘋病，土霉素的防治效果最優。李志朋[13]在懷柔板栗產區于5月份采用樹干打孔注藥鹽酸四環素的方式對不同樹齡的板栗黃化皺縮病進行藥劑治療試驗，結果表明：幼齡樹（15年以下）、中齡樹（16～25年）和成齡樹（26年以上）連續2年的防治效果分別是89.4%、75.8%和66.9%，治愈率分別是66.7%、40.0%和26.7%。林彩麗等[11]對北京懷柔區板栗黃化皺縮病害調查發現，葉蟬、蜷科類及栗斑蚜共9類刺吸式昆蟲中含有植原體，該病害可由刺吸式口器昆蟲吸食汁液進行傳播。關于板栗植原體病害的防治措施還有選育抗病良種、消滅刺吸式昆蟲、清除栗園零星發病樹等方面的少量報道[4]。本研究針對防治效果較好的鹽酸四環素進行田間示范試驗，發現春季展葉期滴注鹽酸四環素會出現葉片發黃、焦枯以及部分枝條叢簇甚至死亡等藥害現象，無法滿足種植戶當年栽培的期望。然而，在秋季采收后落葉前滴注鹽酸四環素，植株則呈現輕微的暫時藥害，再結合落葉后發病枝條修剪以及展葉期葉面噴施蕓苔素內酯和葉面肥等綜合防控措施，板栗植株葉片光滑平整、顏色深綠、大小均一，枝條舒展，栗蓬多而飽滿，適時開裂，板栗殼光滑有光澤，栗仁飽滿，整體樹勢和產量與健康無顯著差異。本研究建立了一套行之有效的綜合防控技術，為板栗黃化皺縮病的防治提供了技術支撐。盡管利用四環素等抗生素在植物植原體病害方面有較好的防治效果，但容易使微生物產生抗藥性，還存在農藥殘留的潛在風險，因此如何利用鹽酸四環素等抗生素科學有效地防治板栗黃化皺縮病還需開展進一步研究。