益氣養陰方對急性心肌缺血模型大鼠的保護作用

代培方，任蓁，牛雯穎，肖洪彬，劉思瑩，劉欣欣，任宇婷，穆欣?

（1. 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）屬于心血管病急癥之一，是由于冠狀動脈出現狹窄、堵塞導致心肌血供突然中斷、心肌供血不足，使心肌細胞缺血、缺氧而引起心肌功能受損和壞死的病理狀態［1-3］。數據顯示，美國和歐洲地區每年分別有約240 萬和400 萬人的因AMI 而死亡［4］。《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，我國心血管病負擔沉重，近年來心血管病死亡連續位居中國居民總死亡原因首位，患病率和病死率呈快速上升趨勢［5］，其中AMI 是關鍵致死因素［6］。AMI 已成為全球迫切需要解決的重大公共衛生問題之一。現代醫學治療AMI 的主要手段有藥物治療、溶栓治療、經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）等［7］。上述方法能夠快速恢復心肌血供、挽救壞死心肌組織，是早期改善臨床結局的最有效的策略。然而冠狀動脈再通治療手段并不能再生和補償心肌細胞死亡的損失，且在恢復缺血心肌血流的同時還可能會帶來再灌注損傷［8］。因此，積極尋找更為有效的AMI 防治方法和藥物至關重要。中醫古籍并沒有“心肌缺血”“心肌梗死”病名，可歸于“真心痛”“胸痹”“心痛”等范疇，《黃帝內經》及現代中醫臨床診療指南均認為AMI 與氣虛、血瘀、痰瘀、寒凝、氣滯、氣陰兩虛等有關，因而臨床多以益氣、活血、養陰、通絡等法為主進行治療［9-10］。多項研究證實，中醫藥防治AMI 具有較低毒性、高生物活性的特點，對心肌缺血損傷有較好的保護作用［11-12］。但尋找更為安全有效的藥物，仍是國內外醫藥界不懈努力的重要方向，而針對藥食同源食療方治療AMI 的研究報道卻鮮有見到。中醫學素來就有“以食代養、醫食同根、藥食同源”的防病、治病理念，因此，利用藥食同源物品研究和開發食療方劑學有著堅實的中醫學理論基礎。

本課題組前期研究建立了《中藥大辭典》《中醫方劑大辭典》藥食同源物質數據庫，從中篩選出具有補氣、養陰、活血作用的益氣養陰方，并經過多名專家論證，確立由黃芪、葛根、西洋參、黃精、山茱萸、山藥、山楂、玉竹、豆豉9 種組成益氣養陰方。大量研究證實本方中的有效成分具有改善心血管功能的相關作用。為探明該方治療心肌缺血的機制，本課題組采用結扎左冠狀動脈前降支經典造模方法制備AMI 大鼠模型，通過檢測分析心電圖變化、血清肌酸激酶（CK）、羥丁酸脫氫酶（HBDH）、谷草轉氨酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）含量、心肌總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、丙二醛（MDA）水平、心肌梗死面積等指標，對益氣養陰方抗心肌缺血的作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF清潔級10周齡健康雄性Wistar大鼠70只，體質量250～280 g，合格證號：SCXK（黑）2019-001，使用許可證號：SYXK（黑）2019-001。實驗前大鼠予自由性飲食水，適應性喂養習慣環境1 周。實驗環境：溫度20～25 ℃，濕度50%～60%，每日徹底清潔消毒1次。

1.2 實驗儀器、試劑與藥物

儀器：MP150 多導生理記錄儀（美國BIOPAC）；HX-200小動物呼吸機（成都泰盟）；KY2000半自動生化分析儀（日本島津）。

試劑：AST試劑盒（貨號：C010-1）、CK 試劑盒（貨號：A032-1）、HBDH 試劑盒（貨號：E005-1-1）、LDH 試劑盒（貨號：A020-1）、T-SOD 試劑盒（貨號：A001-1）、GSH-Px 試劑盒（貨號：A005-1）、MDA 試劑盒（貨號：A003-1）均購于南京建成生物工程研究所；2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京雷根生物技術有限公司）。

藥物：益氣養陰方中各味中藥飲片均購自于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，經藥劑科鑒定，飲片符合2015版《中華人民共和國藥典》標準。經標準煎煮流程制備后，再將藥液后減壓濃縮為1.1 g/mL生藥，4 ℃冰箱冷藏備用，灌胃時加蒸餾水調成所需給藥濃度，溫服；硝苯地平控釋片（10 mg/片，揚子江藥業集團有限公司）；氨基甲酸乙酯（烏拉坦，天津光復精細化工研究所）。

1.3 分組及給藥

按體質量隨機分為7 組，分別為空白組（K 組）、假手術組（J 組）、模型組（M 組）、陽性藥對照組（Y 組）和益氣養陰方高、中、低劑量組（分別為G 組、Z 組和D組）。適應性喂養1周后進行灌胃給藥14 d。按藥理學實驗方法學計算益氣養陰方高、中、低劑量組的給藥劑量分別為22、11、5.5 g/kg；陽性對照組給藥劑量為3.7 mg/kg；正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。除空白組、假手術組外，其余各組連續給藥14 d 后，第15 天行左冠狀動脈前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）結扎術制備AMI 模型，當左心室前壁出現灰白或發紺，心電圖Ⅱ導聯ST 段弓背樣抬高≥0.1 mV時，表示造模成功［13-14］。

1.4 實驗取材和指標測定

1.4.1 心電圖監測

連續給藥14 d 后，采用10%烏拉坦（20 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于放置恒溫動物墊實驗板上，按要求連接MP150 多導生理記錄儀，觀察并記錄大鼠正常狀態下心電圖。LAD 結扎術造模成功后，全程密切觀察心電圖的動態改變并記錄。選取7 個時間節點描記心電圖，分別是麻醉后、結扎成功后、結扎后10 min、結扎后30 min及結扎后1、2、4、6 h。

1.4.2 血清及心肌標本采集

采用腹主動脈采血法采集大鼠動脈血標本。取血4 mL，取血后立即進行離心、分離、分裝、凍存備用。各組均隨機抽取3 只大鼠，取完血后迅速摘取心臟，冷鹽水沖洗干凈心腔殘血，迅速用手術刀切去結扎線以上部分，將結扎部位與心尖部之間的心臟組織以垂直心臟縱軸方向切成3 等份，取近心尖部1/3 的心肌組織，置于-20 ℃冰箱中凍存備用。

1.4.3 TTC染色計算心肌梗死面積

取血后迅速摘取心臟，冷鹽水沖洗干凈心腔殘血，再置于濾紙上吸干水分，盛放于無菌小培養皿并用封口膜封口，再置于-20 ℃冰箱中凍存。TTC染色步驟：①凍存取出；②心臟組織切片；③TTC 染色；④避光溫育；⑤固定、觀察；⑥拍照取圖；⑦計算梗死面積比。觀察心臟組織梗死區呈灰白色，非缺血區呈磚紅色，計算心肌梗死面積比。

心肌梗死面積比= Σ 切片中蒼白區面積× 厚度/Σ 切片總面積× 厚度

1.4.4 血清心肌酶的測定

血清樣本取出后解凍處理，平衡至常溫。用KY2000 半自動生化分析儀酶比色法測定血清肌酸激酶（CK）、羥丁酸脫氫酶（HBDH）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）活性。

1.4.5 心肌組織中抗氧化酶活力的測定

取凍存的心肌組織組織勻漿后，用ELISA 法測定GSH-Px、MDA、SOD含量水平。所有實驗步驟嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學方法

實驗數據結果均以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行處理分析，組間比較采用One-way ANOVA。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心電圖的改變

大鼠LAD 結扎術造模成功后，觀察其心電圖可以發現，與空白組及假手術組相比較，模型組和各給藥組大鼠心電圖ST 段呈進行性弓背向上抬高，T 波直立高尖，呈“小紅旗”樣，振幅增高，提示AMI 模型構建成功；缺血30 min 達到峰值，此后振幅略下降，連續觀察6 h，見圖1。

圖1 造模前后大鼠心電圖變化

2.2 各組大鼠血清心肌酶的變化

與K 組相比，J 組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量變化不大，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與K 組比較，M 組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均明顯升高（P＜0.01）；與M 組比較，Y、D、Z、G 組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），益氣養陰方各組比較無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清心肌酶含量水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清心肌酶含量水平比較（±s）

注：與K組比較，##P ＜0.01；與M組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別K組J組M組Y組D組Z組G組n 10 8 9 9 8 9 9 AST（U/L）70.75±16.21 77.68±13.48 434.96±53.43##334.73±33.64**373.74±47.92*323.79±59.85**350.50±41.55**CK（U/L）302.68±37.63 347.33±53.64 656.19±86.40##475.12±75.64**555.98±62.93*499.36±80.10**501.81±89.15**HBDH（U/L）149.15±48.31 116.25±46.64 501.69±67.40##372.12±57.24**423.35±59.18*371.41±65.39**352.50±67.21**LDH（U/L）241.82±65.91 204.72±60.11 472.23±99.34##353.28±59.50*336.89±61.44*339.76±74.82*357.14±71.86*

2.3 各組大鼠心肌抗氧化酶活力水平的變化

與K 組相比，M 組大鼠心肌中SOD、GSH-Px 的活性顯著降低，MDA 的活性升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與M 組相比，Y、D、Z、G 組大鼠心肌中的SOD、GSH-Px活性均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），MDA 的活性顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活力水平的比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活力水平的比較（±s）

注：與K 組比較，#P ＜0.05##，P ＜0.01；與M 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別K組J組M組Y組D組Z組G組n 10 8 9 9 8 9 9 SOD（U/L）269.16±30.04 270.32±35.51 215.83±26.91##266.58±28.97**255.05±31.17*260.93±26.88**253.41±24.88**GSH-Px（U/L）983.19±99.84 968.60±103.31 795.36±98.90##940.33±99.10**900.91±104.27*947.93±116.16**948.01±117.47**MDA（μmol/L）8.77±1.96 9.06±2.01 12.62±2.34##9.20±1.73**9.93±2.00*9.39±1.35**9.71±1.65**

2.4 各組大鼠心肌梗死面積的比較

K 組、J 組心肌組織的TTC 染色結果是全部磚紅色，沒有蒼白色，表明心肌無梗死；M 組左心室的前壁和側壁呈現大片白色，表明心肌出現大面積梗死。Y、D、Z、G組染色結果顯示，左心室前、側壁的白色面積減少，表明心肌梗死面積有所減少，見圖2。與M 組（33.32 ± 3.81）%相比，Y 組（16.67 ± 1.83）%、Z 組（15.02 ± 1.70）%、G 組（14.18 ± 1.35）%顯著下降（P＜0.05）。見圖3。

圖2 各組大鼠心肌TTC染色結果

圖3 各組大鼠心肌梗死面積的比較

3 討論

近年來，隨著人們不健康生活方式日漸普遍，心血管病危險因素對居民健康的影響越加顯著，我國心血管病的發病率和病死率持續增高，已成為我國居民首位死亡原因［5］，因此尋找能夠降低其患病率的飲食方法顯得尤為重要。在中醫基礎理論指導下的藥食同源食療不僅具有悠久的歷史，而且臨床效果顯著，正契合心血管疾病的防治策略。本研究組方中黃芪、山藥、西洋參性溫味甘平，有補氣養陰、行滯通痹的功效；玉竹、黃精性平味甘、山茱萸性微溫味酸澀，三者并用取養陰固脫之功；葛根、山楂性涼味甘，有行氣、活血、散瘀之功，豆豉性味苦寒，有宣郁、解毒的功效；諸藥合用共奏益氣養陰、活血散瘀之功。黃芪經常用于煎湯或代茶飲食療中，取補氣補虛之功；西洋參為補而不上火的滋補佳品，可切片生用，煎湯、泡飲、口含、研末沖服均可［15］；山藥適于做粥食用，清代名醫張錫純用山藥粥治療多種疾病；山楂自古便是有名的“果子藥”，生食、蒸煮均可，但脾胃虛弱的人不宜多食；葛根用于藥膳自古有之，陶弘景云：“葛根，人皆蒸食之”［16］；山茱萸常用于食療粥或湯佐膳，在食品加工中已應用于果酒、飲品等領域［17］；玉竹與黃精同屬黃精屬的代表性藥食兩用中藥，常見于湯粥、酒方等食療中，有益氣養陰潤燥之功［18］；淡豆豉藥食兩用歷史悠久，廣泛使用于多種食療方及各類烹飪食品中［19］。

AMI 病理生理過程十分復雜，目前大量研究證實主要與氧化應激損傷、炎性反應、鈣超載和細胞凋亡等密切相關。研究表明心肌缺血會導致機體氧化與抗氧化失衡，產生大量活性氧（ROS）物質，導致氧化應激損傷［20-21］。心肌酶廣泛存在于心肌細胞中，大量ROS 造成細胞膜結構嚴重損傷，細胞膜通透性增加甚至破裂，使心肌內這些特異性酶不同程度釋放入血，包括AST、CK、LDH 等［22］，可作為心肌損傷的診斷性標志物［23］。當ROS 攻破細胞抗氧化防御系統后會耗盡細胞內關鍵的抗氧化劑，如GSH、SOD，引起多種酶失活，抑制心肌細胞能量合成，導致Ca2+超載等，進一步加重心肌損傷。脂類物質被氧化后主要分解生成MDA，MDA又會造成細胞DNA 損傷，導致GSH-Px 及SOD 活性降低［24］。因此，以上指標的含量測定心肌細胞損傷的嚴重程度，有助于評價抗心肌藥物的作用效果［25-26］。TTC染色可直觀地觀察心肌組織梗死與缺血情況。

本實驗發現益氣養陰方對AMI 大鼠的心肌細胞損傷具有保護作用。與模型組比較，益氣養陰方低、中、高劑量組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均低于模型組（P＜0.05）。與模型組相比，益氣養陰方低、中、高劑量組心肌中的SOD、GSH-Px活性均升高，MDA 的活性降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。TTC染色結果顯示，D、Z、G組大鼠左心室前壁、心尖部的蒼白面積減少，表明心肌梗死面積有所減少；與模型組相比，益氣養陰方中、高劑量組心肌梗死面積百分比顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

綜上實驗結果，本研究發現益氣養陰方能有效減輕AMI 大鼠的心肌損傷程度，抑制血清心肌酶的釋放，提高心肌中抗氧化酶活性，減輕MDA 水平，從而發揮保護心肌的作用，但其作用機制還需進一步的系統實驗研究進行證明。