重組KP52蛋白在小鼠GV期卵母細胞體外培養成熟的作用及相關機制

錢晨曦，董 杰，雷 暉，陳書強，蘆 潔，金 妮，王曉紅

(空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，陜西 西安 710032)

卵母細胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)是輔助生殖技術之一，即在沒有或很少外源性促性腺激素刺激后，從卵巢組織中收集較小的未成熟卵母細胞，在體外培養體系中培養至成熟的過程[1]。與傳統體外受精聯合胚胎移植技術(in vitro fertilization，IVF)相比，IVM具有諸多優勢，如降低輔助生殖治療的成本，且可不需要IVF過程中的超促排卵治療，避免了高雌激素的風險，可有效預防卵巢過度刺激綜合征的發生[2]；此外，IVM可以充分利用活體取卵中獲得的未成熟卵母細胞，減少卵母細胞的浪費，擴展了安全的供卵途徑，在多囊卵巢綜合征不孕患者的臨床治療和女性生育力保存方面具有廣泛的應用和重要的價值。雖然IVM與傳統IVF相比有諸多優勢，但目前全球IVM的臨床妊娠率(25%～30%)仍顯著低于傳統IVF(45%～50%)。從1965年Edwords團隊首次利用體外培養技術使卵母細胞發育成熟以來，臨床上應用的IVM培養液雖然略有不相同，但主要促成熟因子都是促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)或表皮生長因子[2,3]，該體系最大的問題是卵母細胞核質成熟不同步，從而影響后續胚胎發育潛能，導致臨床妊娠率較低[4]。因此，探索更合適IVM培養液中的促成熟因子、優化IVM培養體系對IVM的推廣應用和發展尤為重要。

Kisspeptin(KISS1)是由KISS1基因編碼的多肽，在體內被水解為不同大小的片段發揮作用，根據其片段大小命名為KP10、KP13、KP54(嚙齒動物中為KP52)，這些多肽片段通過與其受體(kisspeptin receptor，KISS1R)結合后發揮功能。一方面，中樞神經系統-下丘腦的前腹側室周核和弓狀核存在合成和分泌kisspeptin蛋白的kisspeptin神經元[5]，其分泌的kisspeptin蛋白可以與促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)神經元上的KISS1R結合，調節GnRH的分泌，從而發揮對下丘腦-垂體-性腺軸的調節作用[6]。另一方面，在外周組織尤其是生殖發育相關組織，如睪丸、卵巢、子宮、胎盤等組織中廣泛表達KISS1基因及其受體KISS1R[7,8]。Kisspeptin可通過直接作用調節外周生殖器官或組織功能，尤其是在卵巢組織中，顆粒細胞分泌的kisspeptin蛋白通過與其自身和卵母細胞上的受體結合，調節卵泡和卵母細胞的發育成熟[9]。據此，我們推測在當前的IVM體外成熟培養液中添加kisspeptin可能提高卵母細胞成熟率。本研究擬通過在IVM培養液中添加重組小鼠KP52蛋白，探索其對小鼠生發泡(germinal vesicle，GV)期卵母細胞的體外成熟作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

①實驗動物：6周齡C57BL/6J雌鼠，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養環境為恒溫、半日光照半日黑暗環境(早8：00開燈，晚8：00熄燈)，所有飼料、墊料、飲水均經高壓滅菌，自由飲食飲水。所有動物實驗均經空軍軍醫大學動物倫理委員會批準。②重組KP52蛋白：KISS1基因直接合成后連接于pET質粒上并表達于感受態大腸桿菌中，利用Ni柱親和層析法將帶有His標簽的目的蛋白純化出來，并利用蛋白濃縮管進行目的蛋白的濃縮，然后用二喹啉甲酸蛋白定量法檢測目的蛋白濃度，以便下一步實驗中的定量。③主要試劑與儀器設備：孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)為美國Merck Millipore品牌；胎牛血清為美國Gibco品牌；礦物油、srcl2為美國Sigma品牌；M199培養基為美國HyClone品牌；透明質酸酶、M2培養液、CM培養液、KSOM培養液、rFSH均為美國Merck品牌；KP52蛋白購于上海生工生物工程股份有限公司；細胞松弛素B為美國MedChemExpress品牌；LCA-FITC為美國Invitrogen品牌；環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP) 檢測試劑盒購自美國BioVision公司。

1.2 卵母細胞的收集與體外培養

6周齡C57BL/6J雌鼠于下午3：00進行腹腔注射PMSG(7.5IU/只)，48小時后脫頸處死，取出卵巢組織，于37℃提前復溫的M2操作液中用1mL注射器針頭戳破卵泡，在體式顯微鏡下挑選出形態大小均一的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，并用M2操作液洗三次再進行下一步培養。

取出的COCs置于礦物油覆蓋的IVM培養液滴中(IVM培養液需提前于37℃、5%CO2孵箱中平衡4h以上，IVM培養液為50μL/滴，每滴IVM培養液中放入30枚COCs)，于37℃、5%CO2孵箱中靜置培養16～18h，通過觀察其第一極體排出情況來統計成熟率。

1.3 孤雌激活與皮質顆粒染色

挑選發育成熟的MⅡ卵母細胞去除顆粒細胞后移入含5.34mg/mL srcl2的CM培養液中，并于37℃、5%CO2孵箱中培養1h后取出，用提前4h 37℃預熱的KSOM培養液洗5次，再移入含5μg/mL細胞松弛素B的KSOM培養液中，并于37℃、5%CO2孵箱中培養4h，再次用提前4h 37℃預熱的KSOM培養液洗5次，最后移入預平衡過的KSOM培養液中，繼續于37℃、5%CO2孵箱中進行培養。

MⅡ卵母細胞去除顆粒細胞后移入4%多聚甲醛中，室溫孵育30min后移入含0.02% TritonX-100、1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中，室溫孵育10min；然后用含7.5% BSA的PBS室溫下封閉30min，再移入100μg/mL的LCA-FITC中室溫下避光孵育30min進行皮質顆粒染色；而后再移入10μg/mL Hoechst中室溫下孵育30min進行細胞核染色；最后用含0.1% 聚乙烯醇的PBS洗3次后封片，于倒置熒光顯微鏡下采集圖像。

1.4 卵母細胞內cAMP水平檢測

9只6周齡C57BL/6J雌鼠腹腔注射PMSG(7.5IU/只)，平均分三組，第一組48h后繼續給予HCG(7.5IU/只)，然后分別于HCG后1h、2h、3h將小鼠脫頸處死后取卵巢組織進行取卵；第二、三組小鼠PMSG注射48h后立即脫頸處死取COCs，分別進行體外培養，第二組IVM培養液添加FSH，第三組培養液添加KP52蛋白，分別培養1h、2h、3h。每組取5枚去除顆粒細胞的卵母細胞經PBS洗3次后，加入500μL含1% Triton X-100的 0.1N HCl后于4℃冷藏20min，離心(4℃，10 000g)10min，收集上清液。96孔板每孔加入50μL樣品上清液或配制好的標準品和50μL cAMP Reaction Mix，混勻后37℃孵育30min，然后在405 nm處測量熒光強度。

1.5 統計分析方法

2 結果

2.1 不同濃度KP52蛋白作用后卵母細胞體外成熟率的比較

為探索IVM中KP52蛋白的最合適添加量，將COCs在不含KP52蛋白的M199培養基(對照組)和含有不同濃度(0.05nmol/L、0.125nmol/L、0.25nmol/L、0.5nmol/L)KP52蛋白的M199培養液中分別培養16～18 h 后觀察第一極體排出情況。結果如表1所示，與對照組相比，添加KP52蛋白可以明顯提高小鼠GV期卵母細胞的體外成熟率，差異有統計學意義(F=59.725，P<0.01)，其中0.125nmol/L組與其他三種濃度的KP52蛋白組相比卵母細胞成熟率最高，因此后續實驗均選擇0.125nmol/L為KP52蛋白的添加濃度。

表1 不同濃度KP52蛋白作用后卵母細胞體外成熟率的比較

2.2 不同促成熟因子作用后卵母細胞成熟率的比較

為研究KP52蛋白對卵母細胞體外成熟的促進作用與傳統促成熟因子FSH之間的效果差異，將COCs在含有不同促成熟因子的體外培養液中培養16～18h后觀察第一極體排出情況。結果如表2所示，與IVM中的傳統促成熟因子FSH相比，KP52蛋白組卵母細胞成熟率較低，但聯合使用KP52與FSH可以明顯促進卵母細胞的成熟(F=240.556，P<0.01)。

表2 不同促成熟因子作用后卵母細胞成熟率的比較

2.3 不同促成熟因子作用后囊胚形成率的比較

進一步探索KP52蛋白對胚胎發育潛能的影響，將COCs在含有不同促成熟因子的體外培養液中培養成熟后獲得的MⅡ卵母細胞進行孤雌激活，觀察其囊胚形成率。結果如表3所示，與單獨添加FSH組相比，單獨添加KP52蛋白組囊胚形成率顯著升高(F=66.204,P<0.01)，而聯合使用FSH和KP52蛋白組的囊胚形成率與單獨添加KP52蛋白組相比無統計學差異。

表3 不同促成熟因子作用后囊胚形成率的比較

2.4 不同促成熟因子作用后卵母細胞胞質成熟度的比較

為探索KP52蛋白對卵母細胞胞質成熟的影響，將COCs在含有不同促成熟因子的體外培養液中培養成熟后獲得的MⅡ卵母細胞進行免疫熒光染色，觀察皮質顆粒分布情況。結果如圖1A所示，與FSH組相比，KP52組的MⅡ期卵母細胞胞質中央的皮質顆粒向卵母細胞膜下擴散的更明顯(卵母細胞胞質成熟標志之一)。對各組胞質中的皮質顆粒密度進行定量分析后也發現(圖1B)，KP52組MⅡ期卵母細胞胞質中皮質顆粒密度明顯降低(F=48.602，P<0.01)。

圖1 不同促成熟因子作用后卵母細胞胞質成熟度的比較

2.5 不同培養方案中卵母細胞內cAMP水平的動態變化

進一步探索KP52蛋白促進卵母細胞胞質成熟的機制，通過檢測GV期卵母細胞內cAMP水平發現，雖然添加KP52蛋白進行體外培養的卵母細胞中cAMP水平(0.06±0.006)顯著低于體內成熟的卵母細胞(0.14±0.009)，但體內成熟的卵母細胞和添加KP52蛋白進行體外培養的卵母細胞中cAMP水平在2h 均有明顯的增高，而添加FSH進行體外培養的卵母細胞內cAMP水平呈現下降趨勢，詳見圖2。

圖2 不同培養方案中卵母細胞內cAMP水平的動態變化

3 討論

IVM技術自1991年在韓國被應用并成功誕生一名嬰兒以來，全世界累計已有超過5 000例IVM試管嬰兒出生。IVM技術因其安全性高、成本低、卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)風險低等諸多優勢受到廣泛關注，但研究發現與IVF相比，IVM卵母細胞在體外培養成熟過程中由于胞核、胞質發育成熟不同步問題導致其后續胚胎發育潛能和臨床妊娠率較低。為解決這一問題，近些年大量研究者致力于優化IVM培養液或IVM培養過程等相關研究[10]。

3.1 KP52蛋白對GV期卵母細胞體外成熟的影響

既往研究發現，哺乳動物下丘腦中的kisspeptin蛋白可以通過與GnRH神經元上的受體KISS1R結合發揮對下丘腦-垂體-性腺軸的調節功能，從而影響生殖系統的內分泌功能[11]。除此之外，近些年越來越多的研究還發現，KISS1與KISS1R基因同時廣泛表達于外周生殖系統如卵巢組織、子宮組織等，并且發現在卵母細胞及其周邊的顆粒細胞膜表面大量表達KISS1R受體[12,13]，強烈提示kisspeptin蛋白對顆粒細胞和卵母細胞可能發揮直接調節作用。本研究通過在卵母細胞體外培養基中添加重組小鼠KP52蛋白，探索KP52蛋白在IVM中對卵母細胞成熟的影響。結果顯示，KP52蛋白可以促進卵母細胞的體外成熟，雖效果并未優于傳統促成熟因子FSH，但KP52蛋白可以通過提高GV期卵母細胞內cAMP水平而促進卵母細胞胞質成熟，促進卵母細胞胞質、胞核成熟的同步化，提高IVM胚胎發育潛能。

3.2 KP52蛋白促進IVM中卵母細胞胞質成熟的可能機制

環磷酸腺苷(cAMP)在細胞信號轉導中起著關鍵作用，卵母細胞中高濃度的cAMP通過抑制成熟促進因子的激活維持減數分裂的停滯，促進卵母細胞胞質的發育和成熟，調節卵母細胞胞質胞核成熟同步化[14-16]。Albuz F.K等人[16]通過在IVM培養前將牛或小鼠的COCs用腺苷酸環化酶激活劑forskolin處理后增加卵母細胞內cAMP水平，從而顯著提高了牛和小鼠的囊胚形成率、囊胚質量、著床率等。我們的實驗結果也證明GV期卵母細胞內cAMP水平的提高可以通過促進卵母細胞胞質成熟而改善囊胚形成的數量和質量。體外添加KP52蛋白可以模擬出卵母細胞體內發育過程中出現的cAMP激增過程，從而延緩減數分裂的進程，促進胞質的成熟，改善成熟卵母細胞的質量和后續發育能力。臨床研究發現，KP54蛋白體內注射后可以通過提高多囊卵巢綜合征患者顆粒細胞上FSH受體、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)受體以及雌激素受體表達量，從而在不引起OHSS發生的情況下仍能獲得大量成熟卵母細胞[17,18]。但在體外培養環境下，kisspeptin蛋白對卵母細胞和顆粒細胞的作用和影響及可能機制仍處于未知的狀態。我們的研究結果提示體外添加KP52蛋白可能通過直接與顆粒細胞和卵母細胞上的KISS1R受體結合，促進卵母細胞內cAMP水平的升高，提高卵母細胞胞質成熟度及成熟卵母細胞質量，從而改善IVM卵母細胞胚胎發育潛能，提高IVM臨床妊娠率。

綜上所述，我們的研究結果為進一步改善體外成熟卵母細胞質量提供了新的思路和方法，初步揭示了kisspeptin蛋白對小鼠卵母細胞的體外成熟作用，為探索更加有效的IVM培養液提供了新的實驗證據，有助于向人類輔助生殖技術臨床轉化應用。