固相萃取中的常見問題和解決辦法

朱學多,楊義勇,于 佳,陳 明,蘭苗宇,陸書來

（1中國石油ABS技術中心,吉林省吉林市 132021；2中國石油吉林石化公司合成樹脂廠，吉林省吉林市 132021）

對分析檢測人員來說，樣品前處理是至關重要的一環，其占整個分析過程的60%以上的時間，主要的分析誤差也來自樣品前處理環節。固相萃取（Solid Phase Extraction，簡稱SPE）作為樣品前處理的技術之一，得到了越來越廣泛的應用，并在此基礎上，發展出了固相微萃取（SPME）、基質固相分散萃取（MSPDE）、免疫親和（IAC）固相萃取、分散固相萃取（DSPE）和分子印跡固相萃取（MISPE）等新型樣品前處理技術［1］。

本文介紹了固相萃取技術的定義、分類、用途、特點和應用，總結了常見問題及其解決方法，以期為使用固相萃取技術的工作者提供幫助。

1 固相萃取簡介

固相萃取由液固萃取柱和液相色譜技術相結合發展而來，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的一種樣品前處理技術。根據使用固相萃取的目的，可以將固相萃取分為兩類：目標化合物吸附模式固相萃取和雜質吸附模式固相萃取。固相萃取具有分離、凈化、濃縮及轉換溶劑等作用。

2 固相萃取的特點

2.1 固相萃取與液-液萃取的比較

液-液萃取（LLE）雖然是目前使用最廣泛的樣品前處理技術之一，但其在實際操作中還存在一些問題。例如：萃取結果嚴重依賴操作人員的熟練程度；大量使用有機溶劑；乳化層中的目標化合物難于分離；勞動強度大；費時間；難以實現自動化操作［2］。

相對于液-液萃取，固相萃取正好彌補了上述不足，具有如下優點：(1)給定一個固相萃取方法，操作人員比較容易重現實驗結果。(2)在固相萃取中，有機溶劑的使用量比經典的液-液萃取少得多。(3)固相萃取中沒有乳化問題。(4)目前固相萃取填料有許多不同的種類，可以選擇性地分離萃取某類指定的目標化合物。(5)已經實現了自動化操作。

2.2 固相萃取與高效液相色譜的比較

雖然固相萃取和高效液相色譜（HPLC）都是通過液體中的目標化合物在固體填料上進行的吸附及脫附達到分離目的，但兩者之間還是有區別。首先，兩者的目的不同。HPLC的主要目的是在盡可能短的時間里實現對樣品的定性或者定量分析。而固相萃取的主要目的是為了在其他分析設備上實現對樣品的定性或者定量分析而對目標化合物進行分離、凈化或者濃縮。其次，化合物在兩種柱上的行為不同。在HPLC中，樣品進入色譜柱后首先在柱頭聚集，隨著流動相連續不斷地進入，化合物在色譜柱上連續不斷地在固相與液相之間分配以達到分離的目的，這個過程直到化合物流出色譜柱才停止。而化合物在SPE柱上的行為則不同，樣品基質就是流動相。由于SPE柱的填料高度一般都很短，化合物在SPE柱上幾乎沒有分離，要么被吸附，要么隨基質流過。因此，固相萃取是無法分別將混合物中的各組份分離開的。但在某種條件下，固相萃取可以將不同類別的混合物分離。SPE與HPLC的主要區別見表1［2］。

表1 固相萃取與高效液相色譜的對比Table 1 Comparison of solid phase extraction and high performance liquid chromatography

2.3 固相萃取的局限性

每種樣品前處理方法都有一定的局限性，固相萃取也不例外。對于固相萃取，樣品必須呈液態或氣態，否則，樣品無法通過固相萃取柱，只能通過一定的方法，將目標化合物轉移至液體中，然后才能進行固相萃取。

3 固相萃取的應用

固相萃取技術發展到現在，已經在環保分析、食品分析、生命科學和司法鑒定等領域得到應用。

黃思靜等［3］采用超高效液相色譜-高分辨質譜法（UPLC-HRMS）同時測定水體中7種青霉素殘留。水樣經Oasis HLB固相萃取小柱富集和凈化后，用反向C18色譜柱分離，以0.1%的甲酸水溶液和乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式進行檢測。7種青霉素類化合物在1.0~20.0 μg/L的線性范圍內，相關系數r均大于0.99，檢出限為1~10 ng/L。實際水樣加標回收率為91.15%~106.36%，相對標準偏差為2.30%~8.47%，均小于10%。羅斌等［4］采用固相萃取-氣相色譜質譜法測定地表水中硝基氯苯殘留量，并通過萃取條件優化，選擇HLB柱為固相萃取柱，正己烷：丙酮（體積比3：2）溶液為洗脫劑。實驗結果表明，該方法具有實用性強、操作簡便快捷、重復性好、靈敏度高、定性定量結果準確可靠等優點，滿足了地表水中硝基氯苯類物質殘留量的檢測需要。

楊俊等［5］通過優化固相萃取柱和氣相色譜-質譜聯用法的分離條件，建立了一種氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)表明，在0.2~10 μg/mL線性范圍內，9種COPs的相關系數(R2)均大于0.998，方法檢出限低于0.00015mg/kg。3個加標水平(0.5、1、5 mg/kg)的回收率在79.6%和101%之間，相對標準偏差(RSD)低于5%(n=3)。該法具有較高的靈敏度和準確性，可成功應用于食品中9種COPs的含量檢測。張家華等［6］將雞肉、豬肉組織樣品通過甲醇-乙腈（體積比1：1）提取和C18固相萃取柱凈化處理后，進行梯度洗脫，電噴霧電離，在正離子、多反應檢測模式下進行檢測分析，建立了用于豬肉、雞肉中睪酮、甲睪酮、黃體酮等11種同化激素殘留量檢測的超高效液相色譜-串聯質譜法。結果表明，11種目標分析物在實驗濃度范圍內線性良好，相關系數均大于0.99；在10、20、50 μg/kg濃度水平下，豬肉中11種同化激素的平均回收率為74.3%~101.1%，雞肉中11種同化激素的平均回收率為70.1%~97.4%。11種同化激素在豬肉、雞肉中檢測限和定量限分別為0.1~0.5 μg/kg和0.3~1 μg/kg，變異系數均小于15%。所建立的方法靈敏度高、特異性強，可用于豬肉、雞肉中睪酮等11種同化激素的殘留檢測分析。

藍月［7］采用固相萃取技術，以二氧化硅納米粒子為DNA分離純化的新型固相吸附劑，建立了一種快速、高效的DNA分離純化方法，實現了全血中DNA的自動化在線萃取。陳貝貝［8］開發了適合于元素形態分析的新型樣品前處理技術，建立了新型混合涂層改性中空纖維膜管內固相微萃取及磁固相萃取與HPLC-ICP-MS聯用新方法，并成功用于生物樣品中元素形態分析。提出了芯片磁固相微萃取技術與ETV-ICP-MS聯用新方法，并成功應用于細胞分析及蛋白質定量，為金屬組學研究提供了新的技術平臺。

張春水等［9］對吸食過量海洛因死亡者的尿液進行固相萃取處理后，用GC/MS分析，成功從尿液中檢測出海洛因合成副產物單乙酰可待因和海洛因代謝產物嗎啡，這兩種物質同時存在于尿液中，基本認定被測者吸食了海洛因毒品。Strayer K E等［10］采用固相萃取法凈化富集了血液中24中芬太尼類物質，回收率為60.0%~95.0%。固相萃取法是生物樣品中芬太尼類物質提取和富集最常用的前處理方法。

4 固相萃取常見問題與解決辦法

固相萃取中常見的問題主要有以下四個方面：流速問題、回收率問題、污染問題和非萃取問題。

4.1 流速問題

穩定的流速對SPE來說十分重要，尤其在樣品過柱和洗脫步驟，直接影響目標化合物的回收率。流速過快會降低目標化合物的回收率；流速過慢會增加分析時間，降低工作效率。

影響流速的因素主要有以下幾個方面：

（1）隔片。SPE柱上下兩個隔片的作用是固定填料。隔片的孔徑大小不一或者大小不合適，會對流速產生負面影響。如果其邊緣切割的不好，液體就會沿著隔片邊緣沿著柱子內壁流過，而不是通過填料；在運輸或使用過程中也可能會出現填料流失的現象。隔片本身材質的親水性或疏水性對流速也有影響。

（2）裝柱過程。萃取柱的填料裝填過密會限制流速，裝填過松則會導致流速過快，造成回收率和選擇性方面出現問題。

（3）外力。外力不穩定會造成液體過柱流速的不穩定。

（4）樣品本身。樣品本身的黏度和顆粒數量都對流速有影響。黏度大或者樣品中的顆粒較多都會造成隔片微孔的部分或者全部堵塞，進而影響液體過柱的流速。對于黏度大的樣品，可對其稀釋來解決。需要注意的是，稀釋液本身不能含有大量與目標化合物競爭的成分，通常選用適當的緩沖溶液對樣品進行稀釋，并注意緩沖溶液的用量。對于存在大量顆粒的樣品，可采用過濾和離心的方法去除。

4.2 回收率問題

在SPE中，流速能夠直接影響最終的結果，因此，要適當注意流速問題，尤其是樣品過柱和溶劑洗脫時的流速。除此之外，還應注意具體操作中出現的影響因素。

經典的SPE方法包括以下五個步驟：萃取柱預處理；樣品過柱；萃取柱洗滌；萃取柱干燥和目標物洗脫。這五個步驟中的每一步都可能影響方法的回收率和結果的重現性。

（1）萃取柱預處理。在這個步驟中，要選擇適當的溶劑，以便有效地活化SPE柱。溶劑的用量不能過少，用量過少可能導致萃取柱未能充分活化。溶劑流速過快，會形成“溝壑效應”，降低吸附劑與樣品接觸的表面積，導致吸附劑容量的明顯下降，進而導致回收率降低。如果填料已經形成了“溝壑效應”，最好棄用。萃取環境的pH值和離子強度對目標化合物從樣品基質中轉移到萃取吸附劑上也十分重要。通常SPE柱預處理的pH值應該與樣品的pH值相同。

（2）樣品過柱。在這一步驟中，最常見的問題是“柱穿透”，即目標化合物沒有被SPE柱的填料保留，而是隨著樣品基質一起流過SPE柱。這樣勢必造成回收率降低。造成柱穿透的因素主要有：樣品流速過快；萃取柱預處理條件不合適；加入不合適的溶劑（離子強度、有機強度等）；體積超載，保留弱的目標化合物隨基質流失；質量超載，柱容量不夠（目標化合物+基質）；萃取填料不適合目標化合物的保留。其中，樣品過柱的流速影響是最大的。過快的流速導致柱穿透。但樣品過柱的流速并非越慢越好，流速過慢可能會導致樣品基質中的其他成分被保留，從而導致干擾物增加，回收率降低。

（3）萃取柱洗滌。在這個步驟中，容易出現目標化合物流失的問題，造成這一問題的主要原因有兩個：目標化合物在萃取柱上的保留不夠強，洗滌時，部分目標化合物隨溶劑流出萃取柱；所選用的洗滌溶劑對目標化合物的洗脫能力太強，在洗滌干擾物的同時，也洗脫了目標化合物。

（4）萃取柱干燥。干燥的目的是去除殘留的水分和水溶性干擾物。但要注意，過分干燥可能造成目標化合物的流失。

（5）目標物洗脫。洗脫溶劑的洗脫強度應該是以能夠完全破壞目標化合物與填料之間的鍵合為基準。這一步驟中，流速的控制也很重要，必須保證有足夠的時間讓洗脫溶劑與目標化合物進行作用，將目標化合物從吸附劑的官能團中釋放出來。要注意洗脫條件是否恰當，例如pH值、極性、溶解度等。

4.3 污染問題

SPE柱的污染在很大程度上取決于目標化合物的濃度范圍和所使用的檢測手段。SPE柱本身最常見的污染來源于萃取柱的聚乙烯針筒、聚乙烯隔片以及填料中的各種聚合物殘留和鄰苯二甲酸酯。這些干擾物可能干擾對目標化合物的檢測，應該對SPE柱進行預清洗。

4.4 非萃取問題

當回收率偏低時，要對包括樣品前處理在內的每一步進行分析，找出原因。在對萃取方法進行檢查之前，首先要排除由于檢測方法或條件選擇的不正確引起的問題。其次要考慮的非萃取問題是濃縮蒸發，即目標化合物在加熱條件下是否穩定。如果目標化合物在所溶解的溶劑中易揮發，可以降低濃縮溫度或加入沸點較高的溶劑。這些溶劑可以吸收熱量，防止低沸點化合物在濃縮蒸發過程中發生損失。

5 結論

本文綜述了固相萃取過程中的四類常見問題，在具體的操作過程中，應注意避免這些干擾因素，發現問題，首先應從這四方面考慮解決辦法。

(1)在流速方面，要注意隔片的孔徑大小和本身的親、疏水性；裝柱過程中萃取柱填料的松、密；外力是否穩定；樣品本身的黏度和顆粒數量。

(2)在回收率方面，要注意選擇合適的溶劑及用量，避免“溝壑效應”和“柱穿透”，避免出現目標化合物流失，避免過分干燥，注意洗脫條件。

(3)在防污染方面，要注意對SPE柱進行預清洗，杜絕污染源和聚合物殘留。

(4)其他方面，首先要排除檢測方法和條件選擇不當的問題，其次要注意濃縮蒸發過程中發生損失。