基于巨噬細胞可塑性的中藥防治急性肺損傷的研究進展

袁靜 夏金嬋 郭曉琦 江華

河南中醫藥大學醫學院（鄭州450046）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以肺泡/毛細血管通透性增加、肺部炎癥以及肺組織結構破壞為特征的呼吸系統疾病，其中急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是其發展的嚴重形式，主要臨床表現為缺氧和肺順應性降低，是臨床常見的急危重癥，病死率可達30% ～40%［1］。目前，治療ALI/ARDS 在臨床上尚無特效方法，因此為ALI 尋找更好的治療靶點以降低病死率顯得尤為重要。

巨噬細胞參與了ALI/ARDS 的整個發病過程，包括炎癥反應的調節以及肺組織損傷的修復［2］。當大量細菌內毒素隨血流進入肺部，巨噬細胞是最先啟動的防御細胞，可分泌多種促炎/抗炎遞質，參與肺部炎癥反應。巨噬細胞具有高度可塑性，可根據不同微環境的刺激表現出多種功能表型［3］。其中，經典的巨噬細胞極化呈兩種相反的表型狀態：由細菌脂多糖（LPS）或與γ 干擾素（IFN-γ）聯合刺激誘導的促炎M1 表型巨噬細胞以及由白介素-4（IL-4）等誘導的抗炎M2 表型巨噬細胞。在ALI/ARDS 病程中，炎癥可導致巨噬細胞反應的異常重塑，并導致其表型的改變［2］。目前，越來越多學者研究發現中藥復方及其活性成分能夠通過調控巨噬細胞表型由促炎向抗炎方向轉變，從而為臨床防治ALI 提供新的理論參考。本文就巨噬細胞的起源、巨噬細胞可塑性的分子機制以及以中藥調控巨噬細胞極化為靶點防治ALI 等方面研究作一綜述，以期為探索ALI 的發病機制和防治ALI提供新的方向和思路。

1 巨噬細胞的起源

早期通過小鼠體內實驗以及人類的器官移植等研究，發現了組織中的巨噬細胞來源于血液循環中的單核細胞［4-5］。在未受到變應原刺激時小鼠組織中的巨噬細胞并不是來源于血液中的循環單核細胞，例如大腦、皮膚、肝臟、肺等大多數臟器中的巨噬細胞來源于卵黃囊或胎肝［6］。目前多數研究表明，組織中巨噬細胞有雙重來源，如成年小鼠心臟巨噬細胞是由發育過程中組織產生的細胞和循環血液中的單核細胞兩部分組成［7］。與小鼠相比，集落刺激因子-1（CSF-1）誘導成熟的人巨噬細胞增殖較困難，因此推測人類組織中巨噬細胞主要來源于單核細胞，在機體受到外界刺激條件后作為重要的免疫細胞發揮抗感染、抗腫瘤、免疫調節等作用。另外，組織中巨噬細胞在機體生長發育過程中也發揮廣泛的生理作用，例如在心血管系統中，組織巨噬細胞具有組成血管壁以及維持心率等功能［8］；在肝臟中，庫普夫細胞參與膽固醇的外排，在脂質代謝過程中發揮重要作用［9］。因此，研究巨噬細胞的起源對于了解機體穩態、疾病發展進程具有重要意義。

2 巨噬細胞可塑性的分子機制

表觀遺傳學是指在不改變DNA 序列的情況下引起基因水平的變化，如組蛋白修飾、DNA 甲基化、非編碼RNA（ncRNA）等。巨噬細胞的分化與激活以及炎癥反應中巨噬細胞表型的改變也受以上表觀遺傳修飾的調控。

2.1 巨噬細胞分化及活化的表觀遺傳調控

2.1.1 組蛋白修飾 在細胞核中，DNA雙螺旋緊密包裹在組蛋白周圍，這種結構不利于轉錄因子與DNA 結合，而通過組蛋白修飾可實現染色質重塑，進而有利于相關基因的轉錄激活［10］。髓系干細胞中非活性增強子被譜系決定轉錄因子（LDTFs）PU.1 打開，并由H3K4me1 標記實現向巨噬細胞的分化過程，巨噬細胞中啟動增強子在LPS 或IFN-γ刺激下，信號依賴轉錄因子（SDTFs）NF-κB 結合到ATAC-seq 使巨噬細胞向促炎的M1 表型活化；而STAT6 等SDTFs 在IL-4 誘導下向抗炎的M2 表型活化［11］。激活的轉錄因子招募組蛋白修飾酶（HMEs）進行磷酸化、甲基化、乙?；刃揎?，進而利于轉錄的激活或抑制。在啟動子上，SDTFs 可直接與DNA 結合，RNA 聚合酶Ⅱ結合到開放的DNA 序列中使基因穩定轉錄［11］。

2.1.2 DNA 甲基化 DNA 甲基化是一種常見的表觀遺傳現象，通常發生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸中的胞嘧啶第5 個碳原子上，并通過DNA 甲基轉移酶（DNMTs）催化完成。大多數CpG 島位于基因的啟動子區域，當甲基化發生時，富集的DNA 結構阻止轉錄因子進入啟動子區域，從而導致基因失活。在正常生理條件下，DNMTs維持CpG 位點的甲基化，使得一些轉座因子的調控機制得以沉默［12］。研究［13］發現，單核細胞向巨噬細胞的分化與DNA 甲基化有關，但隨后巨噬細胞的激活卻很少有DNA 甲基化改變。

2.1.3 ncRNA ncRNA 通常不翻譯成蛋白質，而在調節基因表達上起重要作用，如微小RNAs（miRNAs）和長非編碼RNAs（lncRNAs）。研究表明，miRNAs 可影響巨噬細胞分化和激活程序，與炎癥疾病的發病機制密切相關。JIANG 等［14］通過靜脈注射負載miR-155 的血清外來體，可增加肺組織中M1 型巨噬細胞的數量，并引起未感染小鼠的肺部炎癥。另外，lncRNAs 在調節巨噬細胞活化中也具有重要作用，SUN 等［15］研究認為，lncRNA生長抑制特異轉錄因子5（GAS5）能夠抑制M2 型活化，進而抑制干擾素調節因子4（IRF4）轉錄，有望成為脫髓鞘疾病的潛在治療靶點。而過表達GAS5 可抑制JAK2/STAT3 信號通路，促進M1 型巨噬細胞的極化［16］。

2.2 疾病中巨噬細胞表型的表觀遺傳調控 炎癥與多種疾病有關，包括癌癥、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、ALI 等。巨噬細胞作為炎癥疾病中的第一道防線發揮重要作用。在疾病狀態下，巨噬細胞向促炎表型分化，導致炎癥反應增強，如ALI、COPD 等疾病中；巨噬細胞向抗炎表型分化時可導致免疫抑制以及防御能力下降，如癌癥等疾病中。

2.2.1 內毒素耐受 巨噬細胞長期暴露于內毒素環境下，使其處于免疫抑制狀態，對隨后的內毒素呈低反應性，即內毒素耐受。巨噬細胞在首次接觸內毒素時，炎癥基因通過TLR4-TRIF-STAT3 途徑被抑制，當機體再次遭受相同刺激時體內的炎癥反應減弱，從而降低患者病死率［17］。從機制上講，巨噬細胞中一些基因在多次接觸LPS 后由于啟動子上沒有發生乙?；?，使其缺乏轉錄激活的條件而發生內毒素耐受［18］。研究認為，這種轉錄無法激活的現象主要是由于某些促炎轉錄因子（如IRF 和STAT2 等）或耐受誘導轉錄因子（如缺氧誘導因子1α 等）受抑制所致［19］。過度的免疫耐受可導致病理性的免疫抑制，如膿毒癥。通過I-BET（一種干擾溴結構域與乙?；M蛋白結合的藥理學抑制劑）預處理巨噬細胞可阻止LPS 誘導的免疫耐受，而經β-葡聚糖處理后可恢復約60%的耐受基因的表達［19-20］，這些研究結果為臨床治療膿毒癥提供了參考。

2.2.2 免疫訓練 免疫訓練是指巨噬細胞等固有免疫細胞經病原體初次刺激后可在短期內對病原體的再次刺激迅速產生較強的非特異性免疫應答的現象。與具有內毒素耐受的抗炎性巨噬細胞表型不同，另一些疾病具有促炎性巨噬細胞表型［21］。研究表明，表觀遺傳重編程在訓練免疫過程中極其重要。在靜息的巨噬細胞中，大多數促炎基因處于受阻構型阻礙了轉錄機制進入驅動促炎因子表達的調節區，在β-葡聚糖、卡介苗、氧化的低密度脂蛋白等刺激下能夠增強該細胞對初次刺激物的二次刺激反應［22］；另外，免疫代謝重編程是訓練免疫的又一發生機制，在動脈粥樣硬化疾病患者的單核細胞/巨噬細胞中，葡萄糖的過度利用促進巨噬細胞分泌大量的促炎因子IL-6、IL-1β，驅動全身炎癥的發生［23］。

3 ALI 中巨噬細胞的可塑性

ALI 是一種炎癥性疾病，多種免疫細胞和肺實質細胞均參與了炎癥反應的發生和發展，其中巨噬細胞是導致炎癥疾病不斷進展的重要免疫細胞之一，其活化促進了炎癥的啟動、放大和損傷的全過程。在ALI 發生發展過程中，通過微環境刺激不同的轉錄因子調控著巨噬細胞的表型改變。

3.1 參與細胞因子信號轉導的轉錄因子

3.1.1 NF-κB NF-κB 家族的SDTFs 介導巨噬細胞的炎癥反應。在未受刺激時，NF-κB 以非活性的形式存在于細胞質中，接觸刺激條件后磷酸化進入細胞核，結合到DNA 上，而后招募組蛋白乙酰轉移酶EP300，從而導致組蛋白乙酰化，轉錄被激活［24］。高遷移率蛋白1（HMGB1）是一種高度保守的核DNA 結合蛋白，可誘導機體發生嚴重的炎癥反應［25］。研究表明，HMGB1 在ALI 和膿毒癥的發病機制中起著重要作用。在ALI 病程中，活化的巨噬細胞分泌HMGB1 到細胞外環境，并且在其表面表達TLR2 和TLR4，向細胞內傳遞信號，進而促進NF-κB 的激活［26］，誘導巨噬細胞向M1 表型極化，并降低M2 表型巨噬細胞的百分比［27］。

3.1.2 STAT IFN-γ 促進巨噬細胞產生炎癥介質，主要是通過STAT1 激活介導的。IFN-γ 與相應的受體結合觸發STAT1 酪氨酸磷酸化，與細胞核內DNA 結合導致下游炎癥相關基因的轉錄［28］。有研究［29］表明，IFN-γ 可通過糖原合酶激酶3 依賴機制抑制細胞因子信號轉導抑制因子3（SOCS3），降低抗炎因子IL-10 的分泌。另外，IL-4 誘導的M2表型巨噬細胞活化主要與STAT6 有關，STAT6 可調控過氧化物酶增殖物激活受體（PPARs）等抗炎基因的轉錄［30］，PPARs 參與機體多種生理反應過程，包括脂質代謝、細胞增殖、分化及凋亡等的過程。PPAR-γ 是其中的一種亞型，在肺疾病中發揮重要作用，如ALI［31］、肺缺血-再灌注損傷［32］等。

3.1.3 IRF IRF 家族的SDTFs 在巨噬細胞激活程序中起著重要作用。其中，IRF1、IRF5 和IRF8 促進促炎巨噬細胞的激活，而IRF3 和IRF4 誘導抗炎巨噬細胞的激活［24］。WANG 等［33］研究發現，IRF5是促炎M1 表型巨噬細胞極化的重要轉錄因子，過表達miR-124 可抑制IRF5 核易位，從而降低M1 表型肺泡巨噬細胞極化。SUN 等［34］通過腹腔注射雨蛙肽誘導急性胰腺炎大鼠模型，并用IRF5 siRNA或IL-4 處理，從支氣管肺泡灌洗液（BALF）中分離出肺巨噬細胞，結果發現經處理后的肺巨噬細胞由M1 表型向M2 表型逆轉。

3.1.4 JNK c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信號通路在炎癥調節中也起重要作用，c-Myc 是JNK 下游典型的轉錄因子［35］。單核細胞趨化蛋白誘導蛋白1（MCPIP1）是一種炎癥相關的核糖核酸酶，在LPS、IL-1β 或單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子刺激作用下激活，可催化促炎細胞因子的降解［36］。ZHANG 等［35］研究表明，MCPIP1 通過抑制JNK/c-Myc 信號通路調控巨噬細胞向M2 表型極化，在膿毒癥誘導的ALI 中發揮保護作用。

3.2 參與ncRNA 信號轉導的轉錄因子 SOCS1是JAK/STAT 信號通路的負向調控因子。研究表明，SOCS1 是miR-155 的已知靶點，通過降低p65的穩定性可抑制NF-κB 的活性。在過表達miR-155 的巨噬細胞中，通過LPS 刺激后SOCS1 蛋白表達含量降低，巨噬細胞中NF-κB p65 蛋白表達量及促炎因子TNF-α 和IL-6 水平明顯升高，而過表達SOCS1 可逆轉miR-155 對巨噬細胞的促炎作用［14］。另外，Kruppel 樣因子4（Klf4）是一種保守的核轉錄因子，在調節巨噬細胞向抗炎細胞分化過程中起著重要作用，現已證實，Klf4 是miR-34a 的作用靶點。miR-34a 在ALI 小鼠模型中表達增強，抑制巨噬細胞中miR-34a，Klf4 表達含量升高，促進向M2表型極化，從而改善肺損傷［37］。此外，還有研究［38］表明，Pellino1（PELI1）能夠通過調節IRF5 的泛素化以及IRF5 的核易位來促進M1 巨噬細胞極化。WANG 等［33］學者進一步研究發現，TGF-β1 通過上調DNA 甲基轉移酶1 來抑制miR-124 表達，從而增加PELI1 的表達以及IRF5 的核易位，促進M1 型巨噬細胞的極化，加重ALI 小鼠的肺組織損傷。

3.3 參與三羧酸循環的轉錄因子 三羧酸循環功能障礙與M1 表型巨噬細胞極化有關，巨噬細胞向M1 表型極化消耗糖酵解過程產生的ATP［39］，導致α-酮戊二酸（α-KG）與琥珀酸比率降低。α-KG 具有抗炎作用，能夠調控LPS 誘導的ALI 小鼠肺組織中巨噬細胞向M2 表型極化；在小鼠肺泡巨噬細胞（MH-S）中，α-KG 能夠增加PPAR-γ 的核易位促進M2 表型巨噬細胞的極化［31］。在體外實驗中，LIU等［31］研究發現，α-KG 能夠抑制MH-S 中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTORC1）/p70 核糖體蛋白S6 激酶（p70S6K）信號通路，從而抑制M1 表型巨噬細胞的極化。

4 基于巨噬細胞可塑性的中藥防治ALI 的研究

近年來，越來越多臨床病例已證明中藥在防治ALI 中具有良好的療效，并通過體內外實驗提供了中藥復方及其活性成分基于調控巨噬細胞可塑性改善肺部炎癥的生物學證據，見表1。

表1 中藥調控巨噬細胞極化的作用機制Tab.1 Mechanism of Traditional Chinese medicine regulating macrophage polarization

4.1 中藥復方 麻黃湯和大承氣湯聯合使用作為肺腸合治方劑用于治療肺部疾病已廣泛用于臨床。王瑞哲等［40］通過動物實驗認為肺腸合治法能夠下調NF-κB 信號通路的激活，并抑制肺泡巨噬細胞M1 極化，促使M2 極化，對LPS 誘導的ALI 大鼠模型肺組織發揮保護作用。國家一級中草藥新藥認證產品體外培養牛黃復方制劑（ICCBco）主要由牛黃、獨腳蓮、虎鞭等成分組成，具有清熱解毒、化瘀消腫、祛瘀、促進組織再生之功效。LI 等［41］研究認為，在血吸蟲病導致的家兔肺部門脈高壓病變模型中，ICCBco 能夠抑制肺泡巨噬細胞活化，改善肺部微循環。舒風解毒膠囊（SJC）（虎杖、連翹、板藍根、柴胡、黃耆、馬鞭草、蘆根、甘草組成）在感染性疾病中具有有效的放大抗炎信號的作用，在銅綠假單胞菌（PAK）感染的急性呼吸道感染的小鼠模型中，SJC 能顯著抑制模型小鼠肺損傷以及腹腔內巨噬細胞炎性細胞因子的分泌［42］。

4.2 中藥活性成分 脫氫木香內酯（DHL）是我國常用的傳統中草藥，從雪蓮和鵝耳菊中提取。DHL 在革蘭陽性細菌誘導的炎癥中具有強大的抗炎作用，WU 等［43］采用脂磷壁酸（LTA）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）進行體內外實驗，結果表明DHL 能夠促使巨噬細胞由M1 表型向M2 表型極化并減弱MRSA 誘導的ALI 小鼠肺部損傷。青萼草是一種治療炎癥的中藥，從青萼草中可分離青萼龍葵糖蛋白（XPS），再從XPS 中純化得到兩種均質糖蛋白XPS5-1 和XPS10-1。REN 等［44］學者初步研究認為只有XPS 和XPS5-1 在體外具有很好的抗炎活性，通過LPS 刺激小鼠巨噬細胞ANA-1，采用ELISA、流式細胞術、Western blot 法等技術檢測巨噬細胞的極化情況，結果表明，XPS 和XPS5-1 下調LPS 誘導的促炎介質的分泌，上調IL-10 分泌，并促進ANA-1 由M1 型向M2 型極化。黃芩苷是從傳統中藥黃芩中提取出的黃酮類化合物，具有良好的抗炎作用。楊冰等［45］學者采用LPS 處理人巨噬細胞U937 模擬體內ALI 的炎癥環境，結果發現黃芩苷能夠抑制U937 向M1 型巨噬細胞極化，并可降低由LPS 誘導的HMGB-1 蛋白的表達。中藥姜黃素可促進幼稚CD4+T 細胞向CD4+CD25+Foxp3+Tregs 分化，減輕ALI 炎癥反應，研究者還發現姜黃素還可促進巨噬細胞由M1 型向M2 型極化，可能是Tregs 分化產生的IL-10 介導的［46］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶的主要成分，具有抗炎、抗氧化等的作用，研究表明，EGCG 可調節巨噬細胞向M2 型極化，降低LPS 誘導的肺部炎癥介質TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達，對小鼠肺組織起到保護作用［47］。另外，3，4-二羥基苯乙醇苷（DAG）具有抗炎、抗氧化等的活性，是在著名中藥大血藤中提取的重要活性成分之一。經盲腸結扎和穿孔（CLP）誘導的ALI 小鼠模型中，流式結果顯示，CLP 組小鼠脾臟及BALF 中M1 型巨噬細胞百分比明顯高于假手術組，而經DAG 治療后可顯著降低M1 型巨噬細胞百分比，而M2 型巨噬細胞百分比未發生明顯變化［48］。

5 結語與展望

表觀遺傳修飾和轉錄因子對不同表型巨噬細胞的調控在ALI 的發病機制中具有重要作用，是未來防治ALI 的潛在靶點。巨噬細胞參與了ALI/ARDS 的整個發病機制過程，通過微環境刺激不同的轉錄因子來調控巨噬細胞表型的改變，如細胞因子、ncRNA 等。在ALI 的防治方法中，雖然抗生素層出不窮，呼吸支持療法也可有效改善ALI 引起的各種并發癥狀，但由于其存在創傷性、抗藥性、藥物毒副作用大且費用昂貴等問題，因此尋求一種更加安全高效的抗炎治療方法顯得尤為重要。鑒于巨噬細胞可塑性在ALI 發病機制中的關鍵作用以及中藥在治療肺炎、腎炎等炎癥疾病中的作用，中藥有望成為防治ALI 的潛在藥物。但目前在ALI 模型中，應用中藥調控巨噬細胞可塑性的分子機制的研究仍然較少，中藥是否能夠調控巨噬細胞可塑性成為防治ALI 的有效靶點還需要進一步研究，從而能夠更加深入了解ALI 的發病機制，為臨床防治ALI 提供新的理論依據。