堿發溫度對毛肚膠原蛋白結構的影響

王立宇，夏楊毅,2, ，趙 鸞

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400700；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400700）

毛肚口感獨特，作為火鍋特色菜品發展潛力巨大。新鮮毛肚通常采用食用堿或蛋白酶進行漲發加工，其中食品級NaOH漲發是最適合發制毛肚的方法[1]，經過處理后口感脆嫩化渣。目前，關于毛肚的研究主要集中在漲發過程中的不同工藝和條件優化等方面[2]，其中研究表明漲發溫度對毛肚產品品質有很大影響，如堿處理毛肚在25 ℃可以獲得最大增重比[3]，碳酸鈉處理毛肚在43 ℃時獲得最佳感官評價[4]，但是關于毛肚蛋白在漲發過程中的性質變化卻鮮有報道。

蛋白質的結構和理化特性對肉制品品質有重要影響，而熱處理溫度等條件會改變蛋白結構從而影響蛋白質性能。研究表明，不同加工溫度處理手段下蛋白的結構存在明顯差異[5]，升高加工溫度會導致魚鱗膠原蛋白中無規則卷曲部分占比增大[6]；肌原纖維蛋白二級結構會隨溫度升高發生改變甚至變性和聚集[7]；升高溫度時肌原纖維蛋白的表面疏水性則先增大后減小，蛋白質的變性程度逐漸加深[8]，是導致刺身蛋白結構變化的主要原因[9]。

毛肚富含膠原蛋白，因此膠原蛋白的結構特性對毛肚品質有重要影響[10]。鹽漬處理對新鮮毛肚膠原蛋白結構具有顯著影響[11]，但漲發條件尤其是漲發溫度對毛肚膠原蛋白結構變化研究仍為空白。為進一步探究堿發溫度對毛肚膠原蛋白的影響，本文選取毛肚為原料，采用NaOH堿發工藝，探究不同漲發溫度對膠原蛋白結構的影響，以期為毛肚安全加工和批量生產提供理論依據和科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃牛毛肚 購于重慶市南岸區水產批發市場，低溫保藏運輸至實驗室后立即處理。置于?20 ℃貯藏備用，使用前于4 ℃的冰箱中解凍；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、甲醇、冰醋酸 重慶市鈦新化工有限公司；胃蛋白酶（1:10000） 范德生物科技有限公司；EDTA、二水磷酸二氫鈉、溴酚藍、四水酒石酸鉀鈉 上海源葉生物科技有限公司；五水硫酸銅Aladdin公司；甘氨酸 Macklin公司；乙二胺四乙酸Biosharp公司；疊氮化鈉 成都市科龍化工試劑廠；以上皆為分析純。尼羅藍 Adamas公司；熒光白 上海阿拉丁試劑公司；Tris biotopped公司；溴酚藍 coolaber公司；牛血清蛋白 Biofroxx公司；SDSPAGE凝膠制備試劑盒 北京索來寶科技有限公司；考馬斯亮藍R250 上海拓旸生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漲發溫度對毛肚膠原蛋白結構的影響 選取清洗處理后毛肚為原料，在料液比（w/v）為1:3.6，食品級NaOH溶液濃度為5 mg/mL，時間為30 min條件下，設置不同溫度處理組（40、45、50、55、60 ℃），室溫為未處理組，研究不同漲發溫度對毛肚膠原蛋白結構的影響。

1.2.2 毛肚膠原蛋白的提取 參考曲文娟等[12?14]的做法，并略作修改。去除新鮮毛肚的表面異物后清洗干凈。200 g毛肚切碎后按照1:10（w/v）的固液比添加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，浸泡72 h除去色素和雜質蛋白。用超純水洗至中性pH。按照1:10（w/v）的固液比添加10%的正丁醇溶液，浸泡48 h除去多余的脂肪，用超純水清洗。按照1:10（w/v）的固液比添加含有胃蛋白酶（酶活力1:10000）的0.1 mol/L醋酸溶液，攪拌72 h。將濾液收集起來合并后用透析袋（分子截留量為8000～14000 kDa）透析脫鹽24 h，真空冷凍干燥、封口包裝，并將樣品置于?20 ℃的冰箱中，供測定指標使用。將處理后的膠原溶液調節pH至7.0左右，透析、真空冷凍干燥。以上所有操作均在低溫下進行。

1.2.3 紫外光譜的測定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同漲發溫度處理后凍干的毛肚的膠原蛋白，制備成0.5 mg/mL膠原蛋白溶液，測量毛肚的膠原蛋白紫外吸收光譜（190～400 nm）。

1.2.4 紅外光譜的測定 參考Noorzai等[15]的方法，略作修改。取1 mg經過冷凍干燥后的樣品，加入100 mg KBr于研缽中研磨均勻，在500～4000 cm?1下掃描。利用測試軟件對毛肚膠原蛋白的紅外光譜進行自動基線校正、平滑、標準化處理后，導出原數據。再利用Peakfit 4.12處理，毛肚膠原蛋白酰胺I區（1600～1700 cm?1），依次進行相關基線校正、Gaussian去卷積、二階導數擬合，分別分析毛肚的膠原蛋白二級結構組成的變化。

1.2.5 熒光光譜的測定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同漲發溫度處理后凍干的毛肚的膠原蛋白，制備成0.5 mg/mL膠原蛋白溶液，測量毛肚的膠原蛋白熒光光譜（310～400 nm）。

1.2.6 表面疏水性的測定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解制作不同加工溫度處理組鹽漬毛肚的1.0 mg/mL膠原蛋白溶液，取1 mL上述膠原溶液和200 μL 1.0 mg/mL溴酚藍溶液加入離心管中，漩渦保持10 min，離心10 min（8000×g），取0.4 mL離心上清液，加入3.6 mL 0.1 mol/L醋酸溶液，振蕩混勻，在595 nm處測定不同溫度處理組膠原溶液的吸光值（A樣品），同時使用0.1 mol/L醋酸溶液作為空白組（A空白）。膠原蛋白的表面疏水性采用如下公式計算：

1.2.7 巰基含量的測定 采用 Disimplicio[16]的方法，略作修改。使用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同漲發溫度處理組的膠原蛋白，配制1.0 mg/mL的蛋白溶液。加入9.0 mL Tris-甘氨酸溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH8.0），離心15 min（10000×g），取4.5 mL上清液加0.5 mL Ellman試劑（4 mg 5,5'-二硫基雙-2-硝基苯甲酸溶解于1.0 mL的Tris-甘氨酸緩沖液），振蕩混勻后，25 ℃條件保持30 min，同時使用0.1 mol/L醋酸溶液作為對照組，在412 nm下測定吸光度。公式為：

式中：13600為摩爾消光系數（L·cm/mol），ρ表示膠原質量濃度（mg/mL）。

建議一個孩子從小學到高中畢業閱讀的課外書最低應該在500本之上，最好在1000本以上。其中包括100本以上各行各業的人物傳記，來奠定孩子人生觀、價值觀、世界觀的基礎。同時注意不但要閱讀，也要寫讀書筆記或者書評。

1.2.8 掃描電鏡分析 分別將凍干的毛肚膠原蛋白固定噴金，設置加速電壓為10 V，使用掃描電鏡觀察毛肚的膠原蛋白微觀結構。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理；采用SPSS 19.0統計分析軟件進行方差分析和顯著性檢驗；采用Origin 2018進行圖像處理。所有試驗均做3次重復測定，試驗數據采用平均值±標準偏差形式表示。

2 結果與分析

2.1 毛肚膠原蛋白的紫外可見光譜分析

如圖1所示，毛肚膠原蛋白在228 nm 處出現最大吸收波長，與報道一致[17?18]。不同溫度處理組的毛肚膠原蛋白的吸光度強度均低于未處理組，且不同漲發溫度毛肚膠原蛋白的吸光度不同。隨著加工溫度的升高，最大吸收峰強度先降低再升高后又降低，毛肚膠原蛋白280 nm附近最大吸收峰波長的變化趨勢與230 nm波段保持一致。說明不同漲發溫度使毛肚膠原骨架發生了明顯變化，這是由于蛋白展開過程中一些疏水性殘基通過加熱產生三重螺旋[19]，膠原氨基酸的殘基所處環境發生了改變。

圖1 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白紫外可見光譜圖Fig.1 UV absorbance spectrum of tripe collagen at different temperatures during the lye macerating

2.2 毛肚膠原蛋白的紅外光譜分析

如圖2及表1所示，酰胺A區與N-H的伸縮振動相關，當N-H參與生成氫鍵時其吸收峰發生藍移[20]。與未處理組相比，處理組酰胺A區最大吸收波長紅移。45 ℃處理組紅移至3410.64 cm?1，明顯高于其他各處理組。隨著加工溫度的升高，酰胺A區的最大吸收波長先紅移后藍移再紅移，說明漲發處理會破壞毛肚膠原蛋白內部的氫鍵數量，且溫度不同、破壞膠原蛋白內部氫鍵數量不一樣[21]。酰胺I、II和III區的范圍能夠影響蛋白質的結構，酰胺I區與肽鏈內羰基（C=O）的拉伸振動相關，是研究蛋白質二級結構的重要區帶[22]。與未處理組相比，處理組酰胺I區最大吸收波長藍移。酰胺I區最大吸收波長隨溫度升高先升高后降低，與酰胺A區變化趨勢相反，可能是由于升高漲發溫度導致毛肚膠原蛋白內部的氫鍵平衡狀態被破壞[23]。酰胺II區與C-N拉伸耦合及N-H伸縮振動相關，酰胺III區參與生成膠原蛋白的三螺旋結構，可以反映膠原蛋白特性[15]。

表1 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白的酰胺帶峰位Table 1 The amide band peak of tripe collagen at different processing temperatures

圖2 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

采用Peakfit 4.12處理毛肚膠原蛋白酰胺I區（1600～1700 cm?1），依次進行相關基線校正、Gaussian去卷積、二階導數擬合，得到不同漲發溫度處理后的毛肚膠原蛋白分峰圖譜。未處理組含有11個峰，不同溫度處理組則含有10個峰，如圖3所示。毛肚膠原蛋白二級結構組成的變化如圖4所示。

圖3 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白酰胺I帶擬合圖Fig.3 Fitting diagram of amide I band treated at different temperatures during the lye macerating

圖4 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白二級結構組成Fig.4 Composition of secondary structure of tripe collagen treated with different temperatures during the lye macerating

由圖4可知，不同漲發溫度處理組β-折疊、α-螺旋、β-轉角相對含量均高于未處理組（P<0.05），而無規則卷曲相對含量低于未處理組（P<0.05）。在膠原蛋白內部，β-折疊作為一種不穩定的中間產物，在外界條件影響下極易發生轉變[24]。在升溫初期（40→45 ℃），α-螺旋與β-折疊相對含量變化趨勢相反，可能是由于毛肚膠原蛋白α-螺旋轉變為β-折疊所導致的[25]。當漲發溫度高于50 ℃時膠原蛋白由于亞基不斷暴露，膠原蛋白結構松散，α-螺旋結構和無規則卷曲結構含量無明顯變化。隨著溫度升高，β-折疊結構含量先升高后降低，β-轉角結構含量先降低后升高，說明二者之間可能存在轉化關系。研究表明，膠原蛋白的二級結構中，β-折疊和α-螺旋易被外界環境影響，一方面α-螺旋不斷轉變為β-折疊，另一方面亞基的降解會導致α-螺旋相對含量增加[26]；這與本研究得到的結果一致。

2.3 毛肚膠原蛋白的熒光光譜分析

由圖5可知，與未處理組相比，不同溫度處理組的最大發射波長隨漲發溫度的升高均發生紅移，說明膠原蛋白發生變性導致部分芳香族氨基酸暴露在蛋白溶液中，極性逐漸增加[27]。隨著溫度的升高，由于膠原蛋白變性加劇，聚集程度加深掩蓋了部分暴露在膠原溶液中疏水基團，毛肚膠原溶液表面疏水性降低，膠原溶液的極性減小[8]。隨著溫度的升高，不同溫度處理組的熒光強度逐漸降低，說明膠原蛋白的變性過程中發生了不可逆轉的聚集生成大膠原分子，減少了膠原溶液中疏水性氨基酸殘基數量，致使熒光強度逐漸降低。

圖5 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

2.4 毛肚膠原蛋白表面疏水性分析

由圖6可知，與未處理組相比，處理組的表面疏水性顯著降低（P<0.05）。隨著加工溫度的升高，處理組表面疏水性先顯著性升高再顯著性降低（P<0.05）。這說明在升溫過程中，膠原發生不可逆的變性，聚集程度較深，導致表面疏水性明顯降低。此外，隨著加工溫度的升高，降低了維持膠原結構的作用力，二硫鍵、氫鍵、范德華力等作用力受到損害，膠原蛋白發生變性，膠原三級結構發生改變，疏水基團逐漸暴露在膠原溶液中，致使膠原溶液環境的表面疏水性不斷升高[28]；當加工溫度高于60 ℃時，因膠原蛋白的聚集程度加深掩蓋了部分暴露在膠原溶液中疏水基團，毛肚膠原溶液表面疏水性顯著降低（P<0.05）。

圖6 不同漲發溫度處理下膠原表面疏水性Fig.6 Collagen surface hydrophobicity at different temperatures during the lye macerating

2.5 毛肚膠原蛋白巰基含量分析

由圖7可知，不同漲發溫度處理組膠原溶液中巰基含量隨溫度升高逐漸增加（P<0.05），說明升溫會導致毛肚膠原蛋白發生變性，膠原蛋白結構展開，暴露出更多巰基[29]。巰基是蛋白中活性最強的功能性基團，分布在蛋白表面的巰基易氧化生成穩定的二硫鍵，通過測定蛋白活性巰基和總巰基含量可以反映蛋白結構的變化及蛋白間的相互作用。

圖7 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白巰基含量Fig.7 The content of sulfhydryl groups in tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

2.6 毛肚膠原蛋白的掃描電鏡分析

不同漲發溫度處理下毛肚膠原蛋白的掃描電鏡圖譜如圖8所示。與未處理組相比，不同漲發溫度處理組毛肚膠原微觀結構發生明顯變化，部分膠原由破碎的葉片狀向球棒狀結構轉變，變性的膠原纖維向明膠結構轉變，但基本保留了部分碎片狀的膠原分子。隨著漲發溫度的升高，膠原分子開始收縮，逐漸卷曲，加快凝集，縫隙減小，片狀膠原破碎。其中，55 ℃和60 ℃處理組葉片狀膠原破碎效果明顯，并且球棒狀膠原開始斷裂，膠原聚集程度加深，膠原發生不可逆轉變性。

圖8 不同漲發溫度處理毛肚膠原蛋白掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

3 結論

本文研究不同溫度（40～60 ℃）的NaOH漲發對毛肚膠原蛋白結構的影響，發現NaOH漲發處理會導致毛肚膠原蛋白最大吸收波長發生明顯偏移，二級結構被破壞，膠原蛋白與其他分子的相互作用力（如氫鍵、疏水相互作用力等）發生改變。NaOH堿發處理對膠原蛋白微觀結構的影響顯著，膠原分子隨溫度升高開始收縮并逐漸卷曲，縫隙減小，片狀膠原破碎。當溫度達到50 ℃時球棒狀膠原開始斷裂，膠原聚集程度加深，膠原發生不可逆轉變性。在今后的研究中可以進一步探究NaOH堿發濃度、時間以及各種酶法處理對毛肚膠原蛋白結構和功能特性的影響，為毛肚加工品質形成機理和工業化生產提供理論支持。