凌云白毫茶多糖超聲波提取工藝優(yōu)化及其抗氧化效果

冼麗清，李 珊 ，馮 彬，梁 儉，劉曉鳳

（1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點實驗室，廣西 百色 533000；2.百色學院材料科學與工程學院，廣西 百色 533000；3.百色學院化學與環(huán)境工程學院，廣西 百色 533000）

茶葉中含有豐富的生物活性物質，如黃酮[1]、多酚[2]、生物堿[3]、茶多糖等。其中，茶多糖是一種包含單糖鏈、蛋白質及礦物質元素等物質的復合物[4]。醫(yī)學及生理學試驗證實，茶多糖具有廣泛的生理活性，如抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、降血脂、降血壓、抑菌消炎、調節(jié)機體免疫力等[5]，尤其在治療糖尿病方面具有特殊的療效[6]。茶多糖已被認定為茶葉中茶多酚之外的另一極具開發(fā)價值的天然產物。凌云白毫為百色凌云、樂業(yè)地區(qū)特產的喬木類大葉茶種，因芽、葉被滿白色絨毛而得名，為當?shù)孛撠毠缘年P鍵經濟作物[7]。受限于當?shù)夭话l(fā)達的地方經濟，凌云白毫作為當?shù)氐拿a品，其生物活性物質如茶多糖的含量及性質研究尚未系統(tǒng)開展，導致評估凌云白毫的生理功能缺乏具體數(shù)據(jù)支撐，推廣乏力。

熱水浸提法是提取多糖類物質的常用方法，可最大程度地保留其物質結構及生物活性的完整性，但也存在耗時長、提取效率低等缺點。為提高提取效率，酶解提取、微波輔助提取、超臨界萃取提取、亞臨界水萃取提取、超聲波輔助提取等提取方法相繼被發(fā)展出來[8]。各種提取方法中，酶解提取受限條件多，酶的活性難以完全發(fā)揮，微波輔助提取產生的瞬時高溫對產物的生物活性有較大影響，超臨界萃取提取、亞臨界水萃取提取需要使用專門的設備，成本高昂。超聲波輔助提取則主要通過超聲波的機械效應、空化效應及熱效應提高小分子物質在介質中的穿透能力，提高其得率的同時對分子結構的破壞性較小，并且操作簡便[9]。劉小辰等[10]比較了熱水浸提、酸輔助提取、堿輔助提取、酶解提取、高壓熱水浸提、超聲波輔助熱水浸提等6種方法對香蕉皮粗多糖提取率的影響，結果顯示超聲波輔助熱水浸提法提取物中多糖含量最高。此外，超聲波也經常聯(lián)用其它技術用于植物活性成分的提取以期發(fā)揮更加優(yōu)越的提取性能[11]。

因此，本文采用超聲波輔助熱水浸提法提取凌云白毫中的茶多糖，優(yōu)化提取工藝，并初步探討多糖類物質的抗氧化效果，填補凌云白毫中茶多糖提取工藝及生物活性研究的空白，并依據(jù)所得數(shù)據(jù)評估茶多糖的含量及其對機體的保健效果，推動凌云白毫在國內的深入推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凌云白毫 有機綠茶，廣西浪伏茶業(yè)有限公司；玉米油 魯花玉米胚芽油（物理壓榨，單烯脂肪酸+多烯脂肪酸>85%），購于百色市盛輝超市；葡萄糖、苯酚、30%過氧化氫、抗壞血酸（VC）、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH自由基） 均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

BSA123-CW電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；820DP高功率數(shù)控超聲波清洗器 深圳市光點超聲波設備有限公司；UV-27000島津紫外可見分光光度計 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器 常州市億能實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 凌云白毫中茶多糖的提取 市售凌云白毫50 g，60 ℃干燥至恒重（前后質量差<0.01 g），粉碎，過篩（d=0.42 mm），得茶粉原料。稱取1.000 g茶粉原料，按比例混合純水，在設定的提取溫度、超聲時間、超聲功率等條件下進行提取，反復2次，合并提取液。Sevage法除蛋白，體系濃縮至50 mL，過濾。濾液轉移至100 mL容量瓶中，純水定容，即為多糖提取液[12]。

1.2.2 單因素實驗 稱取1.000 g茶粉原料，固定基準提取條件：液料比60:1 mL/g、提取溫度50 ℃、超聲時間 20 min、超聲功率150 W[13]。在上述基準提取條件下開展單因素實驗，依次考察液料比（50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 mL/g）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、超聲時間（10、15、20、25、30 min）及超聲功率（100、150、200、250、300 W）等因素對茶多糖提取效果的影響。

1.2.3 Box-Bohnken法優(yōu)化茶多糖提取工藝 依據(jù)單因素實驗所得結果，選取其中的顯著因素為自變量，茶多糖得率為響應值，利用響應面法中的Box-Bohnken法優(yōu)化各因素的水平組合[14?15]，因素水平表如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 葡萄糖標準品回歸方程的建立及茶多糖得率的計算 移取濃度為0.1000 mg/mL葡萄糖標準品溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL至具塞試管中，加純水稀釋至2.00 mL。振蕩過程中，添加5.0%苯酚水溶液1.00 mL、濃硫酸 5.00 mL（分批加入），50 ℃恒溫振蕩10 min，在489 nm處測定體系吸光度A[16]。以吸光度A對葡萄糖標準品溶液濃度c進行線性回歸，得葡萄糖標準品回歸方程：A=17.61c+0.0899，R2=0.9980。按上述方法測定多糖提取液吸光度Aa，帶入葡萄糖標準品回歸方程求得多糖濃度ca，按下式計算茶多糖得率：

式中：ca為經計算所得茶多糖濃度， mg/mL；D為茶多糖稀釋倍數(shù)；V為茶多糖提取液體積， mL；m為茶粉原料質量，mg。

1.2.5 茶多糖的純化及體外抗氧化效果測定

1.2.5.1 茶多糖的純化 混合多批次茶多糖提取液，濃縮至100 mL，過濾。濾液混合4倍量無水乙醇并于4 ℃冷藏24 h，可見容器底部有白色絲狀沉淀。抽濾，固體用丙酮-純水反復沖洗至洗液無色。固體用少量水溶解，DEAE纖維素-52柱層析純化（層析柱1.5 cm×25 cm；純水為洗脫劑，5 mL/min）。洗脫液濃縮，快速冷凍，減壓抽干得灰白色固體，即為茶多糖測試品[17]。稱取一定量測試品茶多糖，配制濃度分別為0.2、0.3、0.5、0.8、1.2 mg/mL茶多糖待測液。

1.2.5.2 茶多糖對羥基自由基（·OH）清除效果的測定

取5支潔凈試管，分別加入不同濃度多糖待測液2.00 mL，8.000 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.00 mL、1.0%過氧化氫溶液2.00 mL。振蕩均勻后，繼續(xù)加入7.000 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.00 mL。上述5個反應體系25 ℃繼續(xù)振蕩60 min，于510 nm處測定體系吸光度Ax1[18?19]，按下式計算茶多糖對·OH的清除率：

式中：Ax1為標準測試組測定體系吸光度；Ap1為對照組（以純水取代過氧化氫溶液）測定體系吸光度；A01為空白組（以純水取代多糖待測液）測定體系吸光度。

1.2.5.3 茶多糖對DPPH·清除效果的測定 取5支潔凈試管，分別加入不同濃度多糖待測液2.00 mL、0.2000 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.00 mL。上述5個反應體系置于黑暗環(huán)境中25 ℃振蕩30 min，于517 nm處測定體系吸光度Ax2[20?21]，按下式計算茶多糖對DPPH自由基的清除率：

式中：Ax2為標準測試組測定體系吸光度；Ap2為對照組（以無水乙醇取代DPPH-乙醇溶液）測定體系吸光度；A02為空白組（以純水取代多糖待測液）測定體系吸光度。

1.2.5.4 茶多糖對油脂（玉米油為例）的抗氧化效果的測定 稱取一定質量的純品茶多糖，混合至玉米油中，使茶多糖在測試樣品中的質量分數(shù)分別為0、0.02%、0.05%。以Schall烘箱法[22]考察茶多糖對玉米油的抗氧化效果，每隔2 d取樣一次并按照國標GB 5009.227-2016[23]中的滴定法測定油體樣品中的過氧化值（POV）。VC作為對照，根據(jù)POV值的波動幅度衡量茶多糖對油脂的抗氧化效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文利用origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)作圖處理；利用SPSS 17.0進行單因素方差分析（P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著）及IC50的計算；利用Design-Expert 8.5 軟件中的Box-Bohnken法優(yōu)化試驗方案并處理數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對茶多糖提取效果的影響 圖1展示，當液料比<60:1 mL/g時，茶多糖得率隨液料比的增加而迅速升高。當液料比>60:1 mL/g時，茶多糖得率略微升高后處于平衡狀態(tài)。提高溶劑用量可增大體系擴散壓并促進茶多糖的溶出。當茶多糖完全溶出或濃度達到平衡時，得率不再發(fā)生顯著變化（P>0.05），而過高的溶劑用量將增加體系的雜質含量及提取成本[24]。所得數(shù)據(jù)經單因素方差分析得P=0.032<0.05，差異性顯著，表明考察范圍內液料比對茶多糖提取具有顯著的影響效果，并選用液料比50:1、60:1、70:1 mL/g進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖1 液料比對茶多糖提取效果的影響Fig.1 The effect of liquid-material ratio on extraction of tea polysaccharides

2.1.2 提取溫度對茶多糖提取效果的影響 圖2展示，當提取溫度<60 ℃時，茶多糖得率隨體系溫度的升高而升高，當體系溫度為60 ℃時的峰值3.72%。繼續(xù)提高體系溫度，茶多糖得率顯著下降（P<0.05）。茶多糖分子的運動活性隨體系溫度的升高而增強，但長時間在高溫環(huán)境中多糖的分子結構易降解并失去生物活性，得率下降[25]。所得數(shù)據(jù)經單因素方差分析得P=0.007<0.01，差異性極顯著，表明考察范圍內提取溫度對茶多糖提取具有極顯著的影響效果，并選用提取溫度50、60、70 ℃進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖2 提取溫度對茶多糖提取效果的影響Fig.2 The effect of temperature on extraction of tea polysaccharides

2.1.3 超聲時間對茶多糖提取效果的影響 如圖3所示，當超聲時間<25 min時，茶多糖得率隨超聲時間的延長而升高，但增速逐漸減慢，當超聲時間為25 min時的峰值3.17%。繼續(xù)延長超聲時間，茶多糖得率下降。延長超聲時間可使植物細胞壁被超聲波充分破碎，但多糖的分子結構長時間在超聲波機械震蕩作用下易被破壞，得率下降[26]。所得數(shù)據(jù)經單因素方差分析得P=0.044<0.05，差異性顯著，表明考察范圍內超聲時間對茶多糖提取具有顯著的影響效果，并選用超聲時間15、20、25 min進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖3 超聲時間對茶多糖提取效果的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction of tea polysaccharides

2.1.4 超聲功率對茶多糖提取效果的影響 如圖4所示，當超聲功率<200 W時，茶多糖得率隨超聲功率的增加而升高，當超聲功率為200 W時的峰值3.42%。繼續(xù)增加超聲功率，茶多糖得率下降。超聲波通過機械作用破碎植物細胞壁，加速多糖的溶出。過高的超聲功率將引發(fā)體系較為劇烈的空化作用，致使多糖分子失活降解，得率下降[27]。所得數(shù)據(jù)經單因素方差分析得P=0.027<0.05，差異性顯著，表明考察范圍內超聲功率對茶多糖提取具有顯著的影響效果，并選用超聲功率150、200、250 W進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖4 超聲功率對茶多糖提取效果的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction of tea polysaccharides

2.2 Box-Bohnken法優(yōu)化茶多糖提取工藝

2.2.1 Box-Bohnken法優(yōu)化提取試驗方案 各考察因素A液料比（mL/g）、B提取溫度（℃）、C超聲時間（min）及D超聲功率（W）為自變量，茶多糖得率（%）為響應值，利用Box-Bohnken法優(yōu)化提取試驗方案，確定29個試驗點。試驗方案及結果如表2所示。

表2 Box-Bohnken法建立提取試驗方案Table 2 Extraction scheme designed by Box-Bohnken method

2.2.2 回歸方程的建立及顯著性檢驗 以Box-Bohnken法對表2所得數(shù)據(jù)進行分析，獲得茶多糖得率（%）與各考察因素：液料比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）及超聲功率（D）的回歸方程：

茶多糖得率（%）=?47.64867+0.83778A+0.73370B+0.47527C?4.90000×10?4D?4.87500×10?3AB+1.15000×10?3AC+1.05000×10?4AD+1.50000×10?3BC+2.65000×10?4BD+5.90000×10?4CD?4.56833×10?3A2?4.58083×10?3B2?0.017823C2?9.17333×10?5D2

采用方差分析法對所得回歸方程進行顯著性檢驗[28?29]，結果見表3。該方程P<0.0001，極顯著；失擬項P=0.0992>0.05，不顯著，說明所得方程可良好匹配試驗操作。決定系數(shù)R2=0.9622，調整決定系數(shù)RAdj2=0.9244，說明因素選取合理，誤差主要由隨機誤差產生并且可控，所得回歸方程可用于試驗預測茶多糖得率隨因素、水平變化的趨勢及幅度。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

回歸方程一次項液料比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）及超聲功率（D）對茶多糖得率的影響均極顯著（P<0.01），根據(jù)F值大小，可知其顯著性順序為液料比>提取溫度>超聲時間>超聲功率。交互項中交互作用AB的影響效果為極顯著水平（P<0.0001），其它交互作用的影響不顯著（P>0.05）。二次項A2、B2、C2、D2的影響均極顯著，其顯著性順序為B2≈A2>C2>>D2。

2.2.3 交互作用的響應面分析 如圖5所示，交互作用的顯著程度與響應面的曲面曲率、等高線中心橢圓率成正比[30]。交互作用AB可見一顯著的下滑曲面，且中心橢圓率最高。其它交互作用各方向曲面下滑平緩，等高線中心橢圓率較低甚至偏圓形。以上結果說明交互作用AB的影響效果顯著高于其它交互作用，此結果與方差分析結果一致。

圖5 交互作用AB對茶多糖提取效果的影響Fig.5 The effect of interactive AB on extraction of tea polysaccharides

2.2.4 最佳提取工藝的獲取及穩(wěn)定性驗證 對回歸方程進行最優(yōu)化處理，獲得茶多糖提取工藝的最佳條件：液料比68.51:1 mL/g、提取溫度52.19 ℃、超聲時間20.70 min、超聲功率178.46 W，茶多糖得率可達5.06%。根據(jù)試驗操作可達水平，將上述條件調整為：液料比69:1 mL/g、提取溫度52 ℃、超聲時間21 min、超聲功率180 W。在此條件下，平行實驗5次，實測茶多糖平均得率為（4.84%±0.04%），與模型預測值相近（<5%），說明該條件具有良好的穩(wěn)定性，可用于茶多糖的提取。此外，根據(jù)茶多糖得率可知凌云白毫茶多糖含量較為豐富，高于國內著名綠茶品牌西湖龍井（3.10%）及信陽毛尖（1.84%）[31]。

2.3 茶多糖體外抗氧化效果

2.3.1 茶多糖對·OH的清除效果 如圖6所示，凌云白毫茶多糖對·OH具有良好的清除效果，其清除能力隨茶多糖濃度的升高而增強，并且高濃度條件下有進一步增強的趨勢。當茶多糖濃度為1.2 mg/mL時，對·OH的清除率為82%。經SPSS17.0軟件分析，凌云白毫茶多糖清除·OH的IC50為0.262 mg/mL，低于VC（IC50=0.027 mg/mL）對·OH的清除能力。

圖6 茶多糖對·OH的清除效果Fig.6 The clearance effect of tea polysaccharides on ·OH

2.3.2 茶多糖對DPPH·的清除效果 如圖7所示，茶多糖對DPPH·具有較強的清除效果，其清除能力隨茶多糖濃度的增加而逐漸增強，但增速減慢并趨近平衡。當茶多糖濃度為1.2 mg/mL時，對DPPH·的清除率為69%。經SPSS 17.0軟件分析，凌云白毫茶多糖清除DPPH·的IC50為0.438 mg/mL[32]，明顯低于VC（IC50=0.072）對DPPH·的清除能力。

圖7 茶多糖對DPPH自由基的清除效果Fig.7 The clearance effect of tea polysaccharides on DPPH radical

2.3.3 茶多糖對玉米油的抗氧化效果 玉米油富含不飽和脂肪酸，長期暴露在空氣中易發(fā)生自氧化反應，導致油體酸敗變質[33]。圖8展示，茶多糖對油脂具有良好的抗氧化效果，添加過茶多糖的油體樣品的POV值較空白樣品均有一定程度的下降，并且下降幅度與茶多糖添加量表現(xiàn)出明顯的量效關系。茶多糖添加量為0.05%時，其抗氧化效果強于0.02%VC；添加量相同時，其抗氧化效果低于VC。

圖8 茶多糖對油脂的抗氧化效果Fig.8 The antioxidant activity of tea polysaccharides on grease

3 結論

本文采用超聲波輔助方式提取凌云白毫茶多糖，并利用Box-Bohnken法優(yōu)化試驗方案，獲得該工藝的回歸方程。方差分析表明，回歸方程極顯著，與試驗操作擬合程度高。對回歸方程進行最優(yōu)化處理獲得茶多糖提取工藝的最佳條件：液料比69:1 mL/g、提取溫度52 ℃、超聲時間21 min、超聲功率180 W。最佳條件下，實測茶多糖平均得率為4.84%，與回歸方程預測值5.06%相當（<5%），說明所得工藝條件具有一定的實用價值，可用于茶多糖的提取。凌云白毫茶多糖對常見自由基如·OH、DPPH·均具有一定的清除效果，其中，對DPPH·的清除能力（IC50=0.438 mg/mL）強于著名綠茶品牌西湖龍井（IC50=0.489 mg/mL）和信陽毛尖（IC50=0.443 mg/mL）。此外，茶多糖可抑制油脂的自氧化反應，延長油脂在常溫常壓環(huán)境中的存儲時間。抗氧化性試驗結果表明凌云白毫茶多糖具有良好的抗氧化效果，并且抗氧化能力與茶多糖濃度成正向關系。凌云白毫茶多糖含量豐富，經常飲用對于維護人體正常的生命活動具有積極效果。茶多糖也可作為一種天然抗氧化劑，具有一定的開發(fā)價值。以上結果可為凌云白毫在國內外的深度推廣及產品開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。