大鯢肉冷藏過程中理化指標及揮發性成分的變化

趙 萍，陳小華,2, ，劉俊霞，王景華，金文剛,2, ，陳德經,2，姜鵬飛

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.漢中市科技資源統籌中心，陜西 漢中 723001；4.大連工業大學國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

大鯢（Andrias davidianus），屬于兩棲綱，有尾目，隱鰓鯢科，是現存個體最大的兩棲動物[1]。大鯢作為我國人工養殖技術較為成熟的重點水生動物品種之一，目前已在陜西漢中、湖南張家界、河南洛陽、重慶等省市實現了規模化人工養殖[2]。大鯢肌肉中含有豐富的蛋白質，必需氨基酸含量高而全面，富含人體常缺乏的賴氨酸，且脂肪含量低，脂肪中不飽和脂肪酸含量高[3?5]，較符合人體需求模式，是人體良好的營養來源[6]。目前，在新冠疫情的影響下，商品鯢滯銷給養殖企業和農戶造成了巨大的損失[7]，大鯢深加工和開發利用成為大鯢產業面臨的主要問題。近年來，研究人員已在大鯢營養價值評價[4]、生物活性成分制備[8]、揮發性氣味分析[9]、貯藏保鮮[10]、產品開發[11?12]等方面進行了較多研究。

大鯢活體宰殺處理程序復雜，分割鮮肉及其速凍產品的上市，不僅消除了消費者處理大鯢的畏難情緒，而且有利于延長產業鏈擴大銷售范圍[9]。但水產品富含不飽和脂肪酸極易氧化酸敗，同時，水分含量較高，營養成分豐富，容易滋生微生物而導致腐敗變質，產生不良腐敗氣味，引起品質劣變。HS-SPMEGS-MS技術中SPME集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，可以萃取食品中的揮發性物質，具有成本低、操作方便等優點[13]，被廣泛的用于水產品貯藏過程中揮發性成分的測定。Zhao等[14]對?2 ℃和0 ℃貯藏的大菱鲆揮發性氣味和TVB-N值進行了研究，發現?2 ℃能延緩TVB-N值的增加，更好的維持新鮮大菱鲆風味化合物，降低醋酸等腐敗化合物含量。賈哲等[15]利用電子鼻及HS-SPME-GC-MS聯用技術對冷藏過程中雙斑東方鲀揮發性物質的種類和相對含量進行分析，發現1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛、壬醛和2,3-辛二酮是雙斑東方鲀在冷藏過程中的關鍵揮發性物質。

課題組前期已利用HS-SPME-GC-MS和氣相離子遷移色譜分析了大鯢肉不同部位以及膠原蛋白的揮發性氣味成分[9,16?17]。目前，在大鯢肉貯藏方面研究主要集中在采用不同包裝方式[10]、貯藏方式[18]、凍結方式[19]來延長大鯢肉的保質期，而大鯢肉低溫貯藏過程中揮發性成分的變化及其與理化品質指標的關聯性，還鮮見報道。本研究以托盤包裝大鯢冷鮮肉為研究對象，在感官評分、TVB-N值、菌落總數的基礎上，采用HS-SPME-GC-MS技術對冷藏過程中揮發性成分變化進行研究，通過理化指標和相關性分析探究冷藏過程中大鯢肉腐敗變質的潛在標記物，為指導大鯢冷鮮肉銷售以及品質控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活健康子二代大鯢3尾（2.5±0.36 kg） 購自漢中市龍頭山大鯢養殖基地；妙潔保鮮膜（材質為聚乙烯，溫度范圍：?60～100 ℃） 購自當地超市；三氯乙酸 阿拉丁公司；甲基紅、亞甲基藍 北京鼎國生物技術有限責任公司；氧化鎂 天津市百世化工有限公司；硼酸 天津市福晨化學試劑廠；鹽酸 杭州匯普化工儀器有限公司；平板計數瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司。

AD18型分散均質機 上海昂尼儀器儀表有限公司；SW-CJ-IFD型潔凈工作臺 上海博迅實業公司；FA3204B型電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司；COHS-250型生化培養箱 常州金壇良友儀器有限公司；Trace GC Ultra型氣相色譜和ITQ900型質譜 美國Thermo公司；Intert Cap-purWax型氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 日本島津公司；手動固相微萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鯢肉樣品制備 鮮活大鯢經放血、熱燙、刮黏液、去內臟和清洗等工序，獲得大鯢胴體，用聚乙烯袋20 min內運回實驗室，去頭、皮、四肢、尾，并切成5.0 cm×2.0 cm×0.5 cm左右的肉塊，放入黑色托盤（23 cm×15.5 cm×3 cm）中并用保鮮膜密封，置于4 ℃冷藏分別于0、1、2、3、4、5、6、7和8 d定期取樣進行理化指標與揮發性成分測定。

1.2.2 感官評價 通過感官方法進行大鯢肉品質評價，評價人員的招募、篩選、培訓參考GB/T 16291.2-2010《感官分析選拔、培訓和管理評價員一般導則》，由在讀食品專業學生志愿者組成。評分前進行感官評價、肉品質評價能力等培訓、經初篩和復篩后確定10名年齡21～22歲食品專業本科生（5男，5女），在食品感官評價實驗室內進行（室溫25±1 ℃），并參照GB/T37062-2018，取適量試樣置于潔凈的白色瓷盤中，對大鯢肉進行感官評價，每個項目采用10分制原則，總分60分，評價人員在整個評價和打分過程中互不干擾，參考Jin等[12]的方法，制定感官評價標準（見表1）。

表1 感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.2.3 TVB-N值的測定 按食品安全國家標準GB5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》半微量定氮法測定大鯢肉冷藏過程中揮發性鹽基氮含量。

1.2.4 菌落總數的測定 按食品安全國家標準GB4789.2-2016《食品微生物學檢驗》菌落總數標準測定大鯢肉在冷藏過程中的菌落總數。

1.2.5 HS-SPME-GC-MS分析

1.2.5.1 樣品前處理 在不同的時間內（0～8 d）定時取出樣品將其切成小于1 cm×1 cm的小塊，密閉置于50 mL血清瓶中，并放在4 ℃的冰箱中備用。

1.2.5.2 頂空固相微萃取 將裝有大鯢肉樣的血清瓶置于50 ℃水浴鍋中，并使用萃取固定裝置固定于水浴鍋中央，水浴30 min。將SPME針頭插入頂空瓶中，調整針頭長度，使萃取頭距離樣品表面約1 cm距離，靜置萃取60 min后取出萃取頭，迅速將其插入GC進樣口中，熱解析3.0 min后進行分析。

1.2.5.3 GC-MS分析 GC條件：色譜柱不分流模式進樣，初始溫度為40 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min升至220 ℃，保持5 min，載氣為氦氣（純度=99.999%），流量為1 mL/min，進樣口溫度200 ℃。

MS條件：電子轟擊離子源（EI），全掃描模式，傳輸線和離子源的溫度均為230 ℃，電子能量70 eV，質譜掃描范圍40～400 m/z。通過系統自帶的NIST 08質譜數據庫進行揮發性化合物的定性確認，取匹配度大于80%的化合物。

1.2.5.4 揮發性成分評價 參考辛茜等[16]的方法，采用相對氣味活度值（ROAV，relative odor activity value）確定各揮發性化合物對氣味的貢獻，當ROAV≥1時，揮發性化合物對樣品氣味具有貢獻作用；當1>ROAV≥0.01，具有重要修飾作用；當ROAV<0.01時，仍有輔助作用。ROAV按下式計算：

式中：CA、TA為物質A所對應的相對百分含量（%）和感覺閾值（μg/kg）；Cstan、Tstan為對樣品風味貢獻最大組分（苯乙醇）的相對百分含量（%）和感覺閾值（μg/kg）。

1.3 數據處理

用Excel對原始數據進行處理、匯總；采用SPSS 25進行顯著性分析，多重比較采用鄧肯法，P<0.05，表示差異顯著；利用origin 2021繪圖并進行Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 大鯢肉冷藏過程中感官品質的變化

感官評分是評價水產原料新鮮度的常用方法，它主要通過人的視覺、觸覺、味覺、嗅覺、聽覺來感知食品特性[20]。圖1顯示冷藏過程中大鯢肉的各感官特性評分均呈下降的趨勢，其中，前4 d有相對較高的感官評分，從第5 d開始感官評分低于30分且大鯢肉的感官特征開始出現不可接受，表現為大鯢肉色澤不均勻，由白色變為微紅色，光澤度下降、外表濕潤，不粘手，切面微濕潤，肉質略疏松、彈性變差、肉湯呈乳白色，無異味。第6、7、8 d感官評分較冷藏前期大幅降低，表明大鯢肉已失去食用價值。在貯藏前期，溫度較低，微生物的繁殖速度較慢，隨著時間的延長，優勢菌群大量繁殖，導致大鯢肉品質的下降；同時，水產品在貯藏過程中蛋白質等含氮物質易被分解，從而產生了水產品腐敗的特征臭味，導致后期感官評定分值快速降低[21]。

圖1 不同冷藏時間大鯢肉的感官評價Fig.1 Sensory evaluation of giant salamander meat at different cold storage time

2.2 大鯢肉冷藏期間TVB-N值的變化

TVB-N值是由具有揮發性的氨、伯胺、仲胺及叔胺等低級堿性含氮化合物組成，此類物質是食品在酶和微生物的作用下，蛋白質及非蛋白的含氮化合物降解產生[22]。通常TVB-N值5～10 mg/100 g判定為優良新鮮；15～25 mg/100 g為新鮮；30～40 mg/100 g為早期腐敗；≥50 mg/100 g定義為腐敗[23]。圖2顯示，隨著冷藏時間的延長，TVB-N值呈增加趨勢，在0～4 d TVB-N值由6.61 mg/100 g增加到12 mg/100 g增長緩慢，在4～8 d TVB-N值由12 mg/100 g增加到47.8 mg/100 g增長顯著（P<0.05），從第7 d（31.6 mg/100 g）開始腐敗。據此可以判定4 ℃條件下大鯢肉0～6 d內相對新鮮，但仍需結合多個指標綜合判斷貨架期。

2.3 大鯢肉冷藏期間菌落總數的變化

微生物指標是衡量水產品腐敗的主要指標之一，可用來預測食品的保質期。如圖3所示，隨著冷藏時間的延長，菌落總數呈上升的趨勢，在0～1 d菌落總數由1.60 lg CFU/g增長到1.75 lg CFU/g增長不顯著（P>0.05），2～8 d由2.4 lg CFU/g增長到8.41 lg CFU/g增長顯著（P<0.05）。通常水產品菌落形成單位（CFU）≤105/g被認為是一級鮮度，≤5×105/g為二級鮮度，超過106/g通常表示肉已經嚴重腐敗變質[10]。托盤包裝大鯢肉在4 ℃貯藏條件下，0～1 d為一級鮮度，2～5 d為二級鮮度，6～8 d其值由6.43 lg CFU/g增加到8.41 lg CFU/g已經超出了可食用水產品的微生物閾值。依據肉制品微生物限量標準，4 ℃冷藏條件下大鯢肉的貨架期為5 d。由感官評價可知，5 d時大鯢肉的感官品質出現了明顯變化，在感官上不可接受，由此可以推斷，微生物評價可以作為大鯢肉腐敗評價指標，但不適合作為單一指標判定大鯢肉的貨架期。在冷藏初期，菌落總數增長速率較慢，主要是由于低溫和pH的降低抑制了大鯢肉中微生物的生長繁殖；隨著貯藏時間的延長，微生物的增長速率逐漸加快，主要是由于腐敗菌對蛋白質和氨基酸等營養物質的利用，從而促進自身的生長繁殖[24]。

2.4 大鯢肉冷藏過程中揮發性氣味分析

利用HS-SPME-GC-MS對冷藏8 d的大鯢肉揮發性氣味進行分析，得到不同冷藏時間的總離子流圖，經過NIST 08質譜數據庫檢索，在大鯢肉中共檢測出58種化合物，其中，醇類14種、酯類12種、酸類9種、酮類6種、烯烴類6種、醛類5種、其他化合物6種，如表2所示，并繪制各類化合物隨時間變化的趨勢圖，如圖4所示。

表2 不同冷藏時間大鯢肉揮發性化合物組成及相對含量Table 2 Composition and relative contents of volatile compounds in giant salamander meat at different cold storage time

圖4 不同冷藏時間大鯢肉中各類揮發性化合物的相對含量變化Fig.4 Changes of relative contents of volatile compounds in giant salamander meat at different cold storage time

續表 2

醇類物質的產生與氨基酸代謝、脂肪降解氧化、甲基酮還原以及微生物生長繁殖密切相關[26]。由圖4可知，醇類物質的含量隨冷藏時間的延長呈下降的趨勢，由0 d的84.07%下降至8 d的32.21%，在7 d及之前其相對含量占有絕對的優勢。其中，辛醇、苯乙醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、1-壬醇的相對含量較高且閾值相對較低對大鯢肉的揮發性氣味貢獻較大。辛醇隨著冷藏時間的延長其相對含量總體呈下降的趨勢，可能與脂肪氧合酶活性下降[27]和微生物的活動有關[28]，辛茜等[16]研究指出辛醇是新鮮大鯢肉腥味的主要成分之一。苯乙醇具有玫瑰、丁香的氣味，在整個冷藏中相對含量較高。1-辛烯-3-醇具有蘑菇味，在4 d相對含量較高為13.05%，其次為0 d（5.53%），其余時間相對含量均低于4%，是由亞油酸的氫過氧化物降解產生，普遍存在于淡水和海水魚中揮發性氣味較重的醇類[29]。芳樟醇呈薰衣草氣味，隨著冷藏時間的延長其含量呈先下降后增加的趨勢。2-乙基己醇、異丁醇、苯甲醇、α-松油醇閾值相對較大，相對含量較低，對大鯢肉的揮發性氣味貢獻較小。

酯類物質作為肉品氣味的重要來源，一般是由酸和醇酯化作用縮合而成[30]。由圖4及表2可知，酯類物質的含量和種類隨著冷藏時間的延長呈增加趨勢，相對含量在0～4 d由1.65%增加到7.79%，增長緩慢，在4～8 d由7.79%增加到46.94%，增長迅速，其相對含量的變化趨勢與醇類物質的變化趨勢相反；物質種類在5 d之前小于2種，從第5 d開始明顯增加到6種，第8 d最多達到10種。以反式-2-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、（Z）-己酸-3-己烯酯、乙酸香茅酯相對含量占比較高，而乙酸芳樟酯、異丁酸丁酯、亞油酸甲酯、（E）-2-己基-丁烯酸甲酯、乙酸丁香酚酯的相對含量小于1%。除亞油酸甲酯、2-（E）-苯甲酸葉醇酯外，其他酯類化合物均是從第5 d開始檢出，酯類化合物的變化與水產品內源酶、微生物代謝與及一些醇和酸的含量有關[27]。2-甲基丁酸乙酯、反式-2-己烯酸乙酯、辛酸乙酯在冷藏后期被檢出且相對含量較高，Casaburi等[31]指出該類乙酯類化合物主要與假單胞菌屬的活動有關，同時也有實驗結果表明，大鯢肉在冷藏中后期（4、6、8 d）的主要菌屬為假單胞菌屬[32]。己酸己酯具有果香味，從5 d開始檢出，第8 d達到最大值4.32%，閾值較低，對大鯢肉冷藏后期的揮發性氣味貢獻較大，周才瓊等[33]指出己酸己酯等n-己酸己酯類化合物，屬于酸肉發酵過程中的揮發性氣味，其在冷藏后期明顯增加，表明大鯢肉品質的明顯下降。

酸類物質在整個冷藏過程中呈波動上升趨勢，波動范圍在0.73%～11.19%之間，在所有酸類化合物中醋酸、正戊酸、壬酸所占比例較高，其余酸類化合物的相對含量均低于1%，酸類化合物閾值較高，對揮發性氣味的貢獻不大。醋酸在8 d的相對含量最高為3.19%，研究表明醋酸的產生主要是由于熱球桿菌和乳酸菌的代謝活動[34]，醋酸含量的積累表明大鯢肉品質的下降[35]。己酸、癸酸、壬酸等是酯類物質形成的重要反應物，在冷藏前期被檢出。酸類物質含量在冷藏過程中呈波動變化，說明脂肪氧化、酮類物質合成、醛類物質生成都處于動態變化過程中[33]。

酮類主要是由不飽和脂肪酸氧化、微生物作用或氨基酸降解產生，對腥味起到增強作用[36]。酮類在冷藏過程中呈波動的趨勢，冷藏前期波動較大且相對含量較冷藏后期高，其中，香葉基丙酮的相對含量隨著冷藏時間的延長呈降低的趨勢，2,3-丁二酮、2-庚酮在冷藏后期被檢出，其相對含量不高，但閾值較低對冷藏后期大鯢肉的揮發性氣味有重要影響，其中，2,3-丁二酮的積累與肉中糖原和脂肪酸分解代謝有關[34]。而甲基庚烯酮、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、環戊酮主要在冷藏前期被檢出，該類物質對冷藏前期的大鯢肉揮發性氣味有一定的作用。

烴類物質主要由脂肪酸烷氧自由基的均裂產生，閾值較高，對肉品風味貢獻不大，但有助于提高其整體風味效果[36]。烯烴類物質含量在冷藏過程中呈波動的趨勢，在第4 d含量最高為8.07%。其中，2-甲基-1-戊烯、（E）-β-金合歡烯、反-2-辛烯的相對含量較高。醛類物質是脂肪氧化的主要產物[27]，其在冷藏前期變化不大，在第5 d大幅增加達到4.79%。乙醛、3-甲基-2-丁烯醛為低級醛，在第8 d檢出，而癸醛、十一醛、十二醛為高級醛呈水果香[37]，該類物質主要在冷藏中后期檢出，相對含量不高，閾值較低，但對冷藏中后期大鯢肉的揮發性氣味有重要作用。其他化合物的占比較小，在0.52%～6.54%之間，其中，苯酚和異喹啉的相對含量較高。P-甲酚在冷藏過程中含量較低且波動范圍較小，苯酚在第4 d相對含量最大為5.14%，辛茜等[16]在新鮮大鯢肉中鑒定出幾種苯酚類物質，因此，P-甲酚、苯酚可能為大鯢肉固有的揮發性物質，它的波動可能與酚類物質的形成過程有關。

2.5 大鯢肉冷藏過程中揮發性化合物聚類和累積分析

聚類分析是將樣品按照其特性相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優先聚合在一起。對大鯢肉冷藏過程中揮發性成分的ROAV值進行聚類分析，結果如圖5（a）所示。同時，將表2揮發性物質的相對含量進行累積統計分析如圖5（b）所示。由圖5可知，當類間距為0.25時，不同冷藏時間的大鯢肉可聚為4類。0～4 d聚為第一類，在此階段A、C類化合物增加較緩慢，B類化合物大幅降低，但B類化合物的比例仍占絕對優勢。第5 d聚為第二類，此階段A類化合物明顯增加，B、C類化合物明顯下降，但A、B兩類化合物占絕對優勢。第6、7 d聚為第三類，第8 d聚為第四類，該階段（6～8 d）三類化合物的波動范圍較小，以A類化合物占絕對優勢，但兩個聚類中三類化合物的的變化趨勢相反。本研究中大鯢肉感官評價結果第7～8 d沒有顯著差異（P>0.05），與聚類結果不一致，可能是因為感官評分是色澤、氣味、彈性、粘性和可接受度等的綜合評價，而聚類分析是根據揮發性成分的相對貢獻大小進行分析。

2.6 感官評分、TVB-N值、菌落總數和揮發性成分相關性分析

選擇圖5（b）中A類化合物經計算ROAV值≥1的揮發性化合物與TVB-N值、菌落總數、感官評價總分進行Pearson相關性分析，結果如圖6所示。由圖可知，TVB-N值與菌落總數、己酸己酯、芳樟醇、2,3-丁二酮呈極顯著的正相關，與2-庚酮、2-甲基丁酸乙酯呈顯著正相關。菌落總數與己酸己酯、芳樟醇呈極顯著的正相關，與2-庚酮呈顯著正相關。己酸己酯與2-庚酮呈極顯著的正相關，與芳樟醇、癸醛呈顯著的正相關。芳樟醇與2-庚酮呈顯著的正相關，2-庚酮與癸醛呈顯著的正相關，2-甲基丁酸乙酯與2,3-丁二酮呈極顯著的正相關，十一醛只與1-辛烯-3-醇呈顯著的正相關，十二醛與其他化合物和指標無明顯的相關性。感官評分與TVB-N值、菌落總數、己酸己酯、芳樟醇呈極顯著的負相關，與2-庚酮呈顯著的負相關。綜上，可將己酸己酯、芳樟醇、2-庚酮、2-甲基丁酸乙酯、2,3-丁二酮作為大鯢肉冷藏期間腐敗變質的潛在標記物。

圖5 不同冷藏時間大鯢肉中揮發性化合物聚類分析（a）和相對含量累積分析（b）Fig.5 Cluster analysis (a) and cumulative analysis of relative content (b) of volatile compounds in meat of giant salamander at different cold storage time

圖6 感官評分、TVB-N值、菌落總數和揮發性成分相關性分析Fig.6 Correlation analysis between sensory score, TVB-N value, total bacterial count, and volatile components

3 結論

通過對大鯢肉冷藏期間的感官品質、TVB-N值和菌落總數進行測定，明確了托盤包裝大鯢肉在4 d內具有較好的新鮮度，第5 d及以后逐漸腐敗；采用HS-SPME-GC-MS技術從不同冷藏時間大鯢肉中共檢測出58種揮發性成分，其中，醇類（14種）、酯類（12種）的相對含量和種類在整個冷藏過程中占有優勢，隨著冷藏時間的延長，醇類相對含量呈下降趨勢，而酯類相對含量呈增加趨勢，其他各類化合物在冷藏過程中呈波動的趨勢；經揮發性成分的ROAV值聚類分析和相對含量累積分析，可以將0～4 d聚為第一類、5 d聚為第二類、6～7 d聚為第三類、8 d聚為第四類；將理化指標與ROAV值≥1且在冷藏中后期呈增加趨勢的揮發性物質進行相關性分析，表明己酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、2-庚酮、2,3-丁二酮、芳樟醇可能為大鯢肉冷藏期間腐敗變質的潛在標記物。今后還需對大鯢肉不同冷藏時間下特征性氣味標記物進行驗證，通過建立氣味標記物與理化品質指標相關性較強的預測模型，以期為大鯢肉冷藏期間新鮮度評價及品質控制提供支撐。