藥食同源中藥材中16種真菌毒素的測定與分析

李鳳華，李作華，楊 麗，員永春，王素香，王愛香，李 蔚, ，鄭鳳家

（1.山東省疾病預防控制中心，山東 濟南 250014；2.山東質安信技術服務有限公司，山東 濟南 250000；3.奧邁檢測有限公司，山東 菏澤 274000）

真菌毒素是一類由產毒真菌在一定環境條件下產生的具有毒性作用的次級代謝產物，目前已知的真菌毒素有300余種[1?2]，其中常見的易對人體產生危害的真菌毒素有：黃曲霉毒素、單端孢霉烯族類毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和赭曲霉毒素等。部分真菌毒素已被證實具有致癌、致畸、致突變作用，對人類健康造成很大威脅[3?5]。中藥是我國醫藥學發展的民族瑰寶，隨著國際社會對中醫藥價值的普遍認可，中藥材的質量安全也備受關注。由于中藥材在種植、采集、加工、儲藏和運輸過程中，諸多條件的變化如干燥不及時、貯存不當、加工制備處理不善等均易使其受到真菌污染，產生有毒的真菌毒素，不僅使其功效成分受到影響，進而可能影響中藥的質量和療效，甚至還會對用藥者的健康造成一定的威脅[6?8]。尤其藥食同源中藥材由于其使用量及使用范圍更加廣泛，其質量安全備受重視。隨著真菌毒素風險評估工作的深入，很多國家和地區開始對部分真菌毒素的含量進行了強制性規定，并制定了嚴格的限量標準[9?13]。

目前，國內外檢測真菌毒素的方法主要有酶聯免疫吸附（ELISA）法[14?16]、薄層色譜（TLC）法[17]、高效液相色譜（LC）法[18?21]、氣相色譜（GC）法[22]、氣相色譜串聯質譜（GC-MS）法[23]和液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法[24?29]等。由于真菌毒素的種類較多，且藥食同源中藥材基質比較復雜，同一樣品可能污染多種真菌毒素，因此，建立同時測定多種毒素且準確可靠的方法非常必要，超高效液相色譜-串聯質譜法檢測真菌毒素的技術日漸成熟，應用廣泛，能夠滿足檢測需求。目前，大部分檢測方法主要針對單類型目標物，而針對中藥材中多種真菌毒素同時檢測的方法SN/T 4604-2016適用范圍窄，且多功能免疫親和柱前處理操作復雜，定量方法采用外標法[30?33]，不能滿足同時檢測復雜基質中多組分目標物的快速檢測要求。

本研究擬采用新型的多真菌毒素快速凈化柱，通過優化液相色譜-質譜條件，建立藥食同源中藥材中16種真菌毒素液相色譜-串聯質譜檢測方法，同位素內標法定量，以期建立能夠校正基質效應，選擇性好，靈敏度高，快捷、簡便、高效，適用于大批量樣品的快速測定方法。并擬采用該方法對采集的483份樣品進行調查分析，為藥食同源中藥材中真菌毒素的安全風險評價監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥食同源中藥材，采集市售藥食同源樣品共483份，按種類分：果實種子類藥材340份，根及根莖類95份，動物類32份，藻菌類16份 均購自濟南市大型藥店；乙腈、甲醇、甲酸、氨水、乙酸 色譜純，德國Merck公司；試驗用水 Millipore純水機制取超純水；標準品：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，

100.0 μg/mL）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV，100.1 μg/mL）、黃曲霉毒素混合標準溶液（AFB1：2.02 μg/mL、AFB2：0.500 μg/mL、AFG1：2.02 μg/mL、AFG2：

0.503 μg/mL）、HT-2毒素（HT-2，100.4 μg/mL）、T-2毒素（T-2，100.1 μg/mL）、伏馬毒素B1（FB1，50.0 μg/mL）、伏馬毒素B2（FB2，50.2 μg/mL）、伏馬毒素B3（FB3，50.2 μg/mL）、玉米赤霉烯酮（ZEN，100.0 μg/mL）、赭曲霉毒素A（OTA，10.04 μg/mL）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-ADON，100.0 μg/mL）、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-ADON，100.1 μg/mL）、Fus X毒素（FuX，100.3 μg/mL）、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（13C15-DON，25.0 μg/mL）、13C15-雪腐鐮刀菌烯醇（13C15-NIV，25.12 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素B1（13C17-AFB1，0.501 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素 B2（13C17-AFB2，0.502 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素G1（13C17-AFG1，0.501 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素-G2（13C17-AFG2，0.501 μg/mL）、13C24-T-2毒素（13C24-T-2，25.2 μg/mL）、13C22-HT-2毒素（13C22-HT-2，25.5 μg/mL）、13C34-伏馬毒素B1（13C34-FB1，25.2 μg/mL）、13C34-伏馬毒素B2（13C34-FB2，10.10 μg/mL）、13C34-伏馬毒素B3（13C34-FB3，10.02 μg/mL）、13C18-玉米赤霉烯酮（13C18-ZEN，25.2 μg/mL）、13C20-赭 曲 霉 毒 素A（13C20-OTA，10.04 μg/mL）、13C17-3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（13C17-3ADON，25.0 μg/mL）、13C17-15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（13C17-15ADON，10.3 μg/mL） 均購自Romer Biopure公司。

Acquity UPLC I CLASS超高效液相色譜儀、XEVO-TQS串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）美國Waters公司；VORTEX GENIE2渦旋混勻器美國Scientific Industries公司；Millipore—Q超純水系統 美國Millipore公司；CR21N型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；Multi Reax（EU）振蕩混勻器

德國heidolph公司，MycoSpinTM400多毒素凈化柱 美國Romer Labs公司；ZM 200超離心粉碎研磨儀 德國Retsch公司；KQ5200E超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準溶液的配制 準確移取標準溶液適量，用乙腈稀釋并定容，配制成DON、3-ADON、15-ADON、NIV、T-2、HT-2、ZEN、FuX濃度為2 μg/mL，AFB1、AFG1為0.8 μg/mL，AFB2、AFG2為0.2 μg/mL，FB1、FB2、FB3、OTA為1.0 μg/mL的混合標準溶液，用于添加回收實驗和制備標準系列溶液，?20 ℃避光條件下保存。

混合同位素內標溶液配制：分別準確移取各同位素標準溶液，用乙腈-水（10/90，V/V）溶液稀釋并定容至25.0 mL，配制成13C15-DON、13C15-NIV、13C18-ZEN、13C17-3ADON、13C17-15ADON濃 度 為250 ng/mL，13C17-AFB1、13C17-AFB2、13C17-AFG1、13C17-AFG2為 10.0 ng/mL，13C34-FB1、13C34-FB2、13C34-FB3、13C22-HT-2濃度為100 ng/mL，13C24-T-2為50 ng/mL，13C20-OTA濃度為20 ng/mL的內標混合溶液，?20 ℃避光條件下保存。

1.2.2 樣品前處理 分別將樣品用超離心粉碎研磨儀粉碎均勻（50目過篩），稱取2.0 g（精確至0.01 g）粉碎后樣品于50 mL離心管中，準確加入10 mL乙腈-水（50:50，V/V），渦旋混勻后，浸泡60 min，室溫下超聲提取30 min，10000 r/min室溫下離心5 min，吸取1.0 mL上清液，加入50 μL乙酸，再加100 μL內標溶液，混合均勻，將混合液倒入MycoSpinTM400多毒素凈化柱中，渦旋2 min，使溶液與凈化材料充分混勻，打開凈化柱底部出液口，置于配套收集管中，收集液于10000 r/min離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.2.3 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm，美國Waters公司）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量為2 μL；ESI-模式：流動相A：0.2%氨水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫程序：0 min，流動相B：2%；0～4.0 min，流動相B：2%～20%；4.0～5.5 min，流動相B：20%；5.5～5.6 min，流動相B：20%～100%；5.6～6.2 min，流動相B：100%；6.2～6.5 min，流動相B：100%～2%。ESI+模式：流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈+甲醇（50/50，V/V），梯度洗脫程序：0 min，流動相B：10%；0～1.0 min，流動相B：10%～30%；1.0～3.0 min，流動相B：30%～40%；3.0～5.0 min，流動相B：40%～70%；5.0～7.0 min，流動相B：70%；7.0～7.2 min，流動相B：70%～100%；7.2～7.7 min，流動相B：100%；7.7～8.0 min，流動相B：100%～10%。

1.2.4 質譜條件 檢測方式為多反應監測（MRM）；ESI掃描方式為正、負離子掃描。離子源溫度為150 ℃，去溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔反吹氣流速：150 L/h；去溶劑氣流速：800 L/h；ESI+模式下毛細管電壓為3.5 kV，ESI-模式下毛細管電壓為2.0 kV；16種真菌毒素及內標的部分質譜參數見表1。

表1 16種真菌毒素及對應的同位素內標的質譜優化參數Table 1 Optimized mass spectrometry parameters of 16 mycotoxins and their corresponding isotopic internal standards

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系、檢出限與定量限的考察 準確吸取16種真菌毒素混合標準溶液適量，用乙腈-水（10/90，V/V）溶液配制成系列梯度混合標液（AFB1、AFG1為0.32、0.8、2、4、8、20、40、80 ng/mL；AFB2、AFG2為0.08、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL；FB1、FB2、FB3、OTA為0.4、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 ng/mL；其余毒素濃度為0.8、2.0、5.0、10、20、50、100、200 ng/mL），取1.0 mL混合標液，加入50 μL乙酸，100 μL混合同位素內標溶液，渦旋混勻后過0.22 μm濾膜，上機檢測。以不同濃度的各目標物的峰面積與其內標峰面積比值對應相應的質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。按照三倍信噪比（3 S/N）計算檢出限，10倍信噪比（10 S/N）為定量限。

1.2.5.2 加標回收率、精密度試驗 選擇杏仁、山藥、雞內金、茯苓4種基質空白樣品，分別加入低、中、高三個水平的混合標準溶液，每個加標水平進行6次平行測定，按照1.2.2方法進行前處理，液相色譜質譜聯用儀分析，根據測定結果計算三個加標水平下的回收率及其相對標準偏差，以驗證該方法的準確性。

1.3 數據處理

采用內標法進行定量，應用Waters Masslynx儀器配置工作站系統進行數據采集處理，并使用Excel 2010進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

將16種真菌毒素以及15種同位素內標分別用乙腈-水（10/90，V/V）稀釋配制成適宜濃度的標準溶液（50～100 ng/mL），用流動注射泵直接注入質譜儀，根據各目標化合物分子的化學電離性質，DON、3-ADON、15-ADON、NIV、ZEN、FuX采用負離子模式，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、FB3、HT-2、T-2、OTA采用正離子模式，對各化合物及其內標的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數進行優化。優化后的質譜條件見表1。由于正負離子同時掃描會降低方法的靈敏度，本方法采用正、負離子檢測模式分別對目標化合物進行測定。

2.2 色譜分離條件的優化

優化質譜條件后，進行液相色譜分離條件的優化。流動相的組成和配比會影響目標化合物的色譜行為，以及其離子化效率和檢測靈敏度。經查閱文獻以及根據各個化合物的分子結構特征，本實驗比較了甲酸、氨水等溶劑的加入情況及乙腈、甲醇流動相系統的組成，結果發現，在負離子模式下，流動相有機相采用乙腈，水相中加入0.2%氨水后，有利于化合物的離子化，并可以得到較高的檢測靈敏度和更好的分離度。故最終確定了乙腈-0.2%氨水作為流動相。在正離子模式下，流動相水相中加入0.1%甲酸，有機相采用甲醇-乙腈（1+1）條件下，各目標化合物分離度和靈敏度均更好。并通過優化梯度洗脫，各目標化合物達到較好的分離，色譜峰峰形良好。圖1為16種真菌毒素標準溶液及其內標離子流圖。

圖1 16種真菌毒素標準溶液及其內標離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 16 mycotoxins standard solutions and their internal standards

2.3 樣品凈化條件的優化

藥食同源中藥材基質比較復雜，為了能夠更好的去除干擾物，降低基質效應，本實驗對樣品的凈化條件進行了優化，由于多毒素免疫親和柱前處理復雜，耗時較長，可測的毒素種類不能覆蓋待測的16種毒素，本實驗以雞內金提取液配制基質標準溶液只針對Mycosep226凈化柱、Oasis HLB柱和MycoSpinTM400多毒素凈化柱進行了比較，結果如圖2所示。Mycosep226凈化柱和Oasis HLB柱凈化效果不理想，對ZEN、伏馬毒素等的回收率較低。因此本實驗采用MycoSpinTM400多毒素凈化柱對樣品進行凈化，可以降低藥食同源中藥材復雜基質對毒素檢測的干擾，達到凈化效果。

圖2 不同凈化方式對回收率的影響Fig.2 Effect of different purification methods on recovery

2.4 定量方法的確定

應用UPLC-MS/MS對復雜基質樣品中目標化合物進行分析時，為了校正樣品凈化過程和離子化過程的損失以及減少基質效應，保證定量結果的準確可靠，通常采用基質匹配溶液加標法或空白溶劑內標法進行定量測定。由于藥食同源中藥材基質多種多樣，而本文擬建立適用性更高的多種毒素同時測定的方法，因此，選擇應用空白溶劑內標法進行定量檢測。在內標化合物的選擇上主要考慮目標化合物的結構、性質盡可能相似，除FuX外，本研究使用各個化合物的穩定性同位素[13C]作為指示內標，由于FuX難以找到同位素內標，因此，使用性質接近的13C15-DON作為其內標物進行檢測。

2.5 工作曲線和檢出限、定量限

本方法所確定的實驗條件下，用乙腈-水（10/90，V/V）溶液配制系列濃度的真菌毒素標準溶液并分別進行測定，以相應真菌毒素的濃度為橫坐標（X），目標物的峰面積與同位素內標的峰面積之比為縱坐標繪制工作曲線。結果表明，在一定的濃度范圍內，各化合物呈良好的線性關系（R>0.998），線性回歸方程、相關系數見表2，并以3倍信噪比（3 S/N）和10倍信噪比（10 S/N）計算檢出限和定量限，各真菌毒素的檢出限在0.1～4.0 μg/kg之間，定量限為0.3～10.0 μg/kg。

表2 16種真菌毒素的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges, detection limits and quantification limits of 16 mycotoxins

2.6 精密度與回收率試驗

分別稱取一定質量的不同基質的空白樣品杏仁（果實種子類）、山藥（根及根莖類）、雞內金（動物類）、茯苓（藻菌類），添加3個濃度水平真菌毒素混合標準溶液，按實驗方法進行處理測定，每個添加水平平行測定6份，考察方法的回收率與重現性，結果見表3。不同基質樣品16種真菌毒素的加標回收率范圍為83.4%～102.3%，相對標準偏差（RSD，n=6）為2.08%～13.6%。說明方法回收率與精密度良好。

表3 精密度及回收率試驗結果（n=6）Table 3 Results of test for precision and recovery(n=6)

2.7 實際樣品的檢測

利用已建立的方法，采集市售藥食同源樣品483份，包括果實種子類藥材340份，根及根莖類藥材95份，動物類藥材32份，藻菌類藥材16份，其中，陽性樣品中檢出各種真菌毒素的平均值及檢出率見表4，共檢出陽性樣品77份，檢出率15.9%，其中，果實種子類藥材檢出率為16.8%，動物類藥材檢出率34.4%，根及根莖類檢出率9.47%。檢出毒素種類最多的是薏苡仁，其中，一份薏苡仁樣品檢出6種毒素，兩份檢出5種毒素；其次是雞內金，有六份樣品檢出4種毒素。毒素檢出率較高的藥材分別是枳椇子（4/4，檢出批次/總批次）、薏苡仁（10/11）、雞內金（11/13）、大麥芽（7/14）和桃仁（4/9），其中，在枳椇子和雞內金的陽性樣品中均檢出玉米赤霉烯酮（ZEN）。

表4 真菌毒素平均值及檢出率Table 4 Mean values and detection rates of mycotoxins

3 結論

本文建立了同位素標記-超高效液相色譜/質譜法檢測藥食同源中藥材中16種真菌毒素的檢測方法。通過優化樣品前處理方法、色譜條件和質譜條件，目標化合物分離度及線性關系良好，而且方法操作簡單，準確、可靠，適用于藥食同源中藥材中多真菌毒素的檢測，并利用此方法對市售483份藥材進行了檢測，為藥食同源中藥材中真菌毒素污染狀況調查提供了數據支持。但是，由于具體到每種藥材的樣品數量較少，覆蓋面欠缺，為了研究具體藥材的污染情況，下一步需要針對具體的藥材加大采樣量，得到更加全面、有代表性的數據結果。