QuEChERS結合超高效液相色譜-串聯質譜法同步測定魚肉制品中24種磺胺類抗生素

李 朔，張 璨，馬 玲，王 可,, ，楊莉麗，花中霞，張夢妍

（1.河北師范大學化學與材料科學學院，河北 石家莊 050024；2.石家莊市疾病預防控制中心，石家莊市化學毒物檢測及風險預警技術創新中心，河北 石家莊 050011）

磺胺類抗生素是一類具有對位氨基苯磺酰胺結構的抗生素總稱[1?2]，具有較強的抗菌能力，被廣泛應用于預防和控制水產養殖過程中的各種動物疾病，除此之外，還被認為是一種飼料添加劑以促進水產養殖動物生長[3?4]。其作用原理是通過競爭性阻抑葉酸循環過程中的對氨基苯甲酸來達到減少和殺滅細菌核蛋白的目的[5]。此類人工合成的抗生素具有價格低、抗菌范圍廣、高效、不易分解[6]等特點，但其在動物體內具有作用時間較長、較慢代謝速率等問題，一部分會在動物體內殘留，另一部分會隨排泄物以原型或代謝物的形式排出體外[7?8]。過量使用磺胺類抗生素會對環境造成一定程度的污染，進而通過食物鏈在人體內蓄積從而對人體健康造成潛在威脅[9]。磺胺類抗生素長期存在于人類體內會引起急性或慢性中毒，還會影響機體的泌尿、免疫系統，破壞人體的造血系統或產生耐藥性等[10?11]。針對動物組織及牛奶中的磺胺類抗生素，歐盟規定其最大殘留量為100 μg/kg[12]。我國國家標準GB 31650-2019制訂了在動物性食品中磺胺二甲嘧啶的限量為25～100 μg/kg，其他磺胺類抗生素殘留總和為100 μg/kg[13]。

目前，對魚肉中磺胺類抗生素的檢測多為其中一種或幾種，同時對20種以上磺胺類抗生素的檢測報道較少。而且與文獻報道的檢測魚肉中磺胺類抗生素的液液萃取法[14]、加速溶劑萃取法[4]、固相萃取法[15?17]等前處理技術相比，QuEChERS法具有操作簡便、無需昂貴的儀器、試驗成本低、應用范圍廣等優點。近年來，磺胺類抗生素的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[18?20]、液相色譜-串聯質譜法（LCMS/MS）[21?24]、毛細管電泳法[24?25]等。其中，液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、準確度好、能同時分析多種痕量物質等優點[26]，適用于多種磺胺類抗生素的檢測。如：HOFF等[27]基于液相色譜-串聯質譜技術發展了一種測定牛肝中6種磺胺類抗生素的新方法；WANG等[28]建立了超高效液相色譜-串聯質譜法分析了畜禽糞便中17種磺胺類抗生素；MARTINS等[29]發展了液相色譜串聯質譜法測定牛奶中11種磺胺類抗生素的檢測新方法。

魚作為營養豐富、價格低廉的水產品之一，其組織中磺胺類抗生素的殘留檢測方法已有報道，而關于基質更加復雜的魚肉制品中磺胺類抗生素的檢測卻鮮有報道，因此本文開展魚肉制品中磺胺類抗生素的檢測研究，對完善食品安全監測體系具有重要意義。為此，本研究通過優化QuEChERS前處理方法、色譜和質譜條件，開發了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定魚肉制品中24種磺胺類抗生素的檢測方法，為開展魚肉制品中磺胺類抗生素的殘留監測及風險評估提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磺胺脒 純度>99.0%，美國International Laboratory公司；其余磺胺類抗生素標準品 純度>97.0%，德國Dr. Ehrenstorfer Gmb H公司；甲酸、乙酸銨 色譜純，美國Dikma公司；甲醇 色譜純，美國Fisher公司；乙腈 色譜純，德國Merck公司；N-丙基乙二胺（PSA） 美國Dikma公司；C18（40～50 μm） 美國Welch公司；無水硫酸鎂、氯化鈉分析純，天津永大化學試劑有限公司；ZORBAX Eclispse XDB-C18（4.6×100 mm，1.8 μm）、ZORBAX SB-Aq（2.1×150 mm，3.5 μm）、ZORBAX Eclispse Plus C18（2.1×100 mm，1.8 μm） 美國Agilent公司；魚肉罐頭、魚豆腐、魚腸、魚丸和魚皮等魚肉制品當地超市。

AB SCIEX Exion超高效液相色譜儀、TRIPLE QUAD 5500三重四級桿串聯質譜儀（配電噴霧源（ESI）及AB SCIEX數據處理軟件） 美國AB SCIEX公司；EVAP-12氮吹儀 美國Organomation公司；VXMNAL渦旋振蕩器 美國OHAUS公司；T-460/H超聲清洗器 德國Elma公司；Milli-Q超純水機 美國Millipore公司；CR21N高速冷凍離心機 日本日立公司；AE240（精度1/105）電子天平瑞士Mettler Toledo公司；GM 200研磨機 德國Retsch公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 稱取適量的磺胺類抗生素標準品采用乙腈溶解，配制成1 g/L的單一標準儲備液，于?20 ℃冰箱中密封儲存。取適量的各標準儲備液，以乙腈定容，得到1 mg/L的混合標準溶液[30]。采用魚肉罐頭空白溶液逐級稀釋配成各標準物質濃度均為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取粉碎后的樣品1.0 g（精確至0.01 g），放入50 mL離心管中，加入超純水2 mL和乙腈10 mL，充分渦旋混勻，超聲5 min后加入NaCl 1.5 g，渦旋30 s，以8000 r/min在4 ℃下離心5 min。移取7.5 mL上清液至盛有C180.3 g和無水MgSO40.4 g的離心管中，渦旋混勻30 s，以8000 r/min離心5 min，取上層乙腈5 mL，在40 ℃下氮吹濃縮至近干，用1.0 mL初始流動相復溶，經0.20 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 液相色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0.0～7.5 min，21% B；7.5～7.6 min，21%～40% B；7.6～11.0 min，40%B；11.0～11.1 min，40%～75% B；11.1～15.0min，75%B；15.1～18.0min，21% B。

1.2.4 質譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：40 psi；噴霧氣：50 psi；輔助氣：50 psi。24種磺胺類抗生素的詳細質譜參數見表1。

表1 24種磺胺類抗生素的質譜參數Table 1 Mass spectrometric (MS) parameters for 24 sulfonamides

1.3 數據處理

采用Analyst軟件1.6.3控制儀器、采集數據，MultiQuant 3.0.2軟件進行數據處理和標準曲線建立。回收率及信噪比采用Microsoft Office Excel 2007軟件計算。提取劑優化和凈化劑優化中的回收率的計算均采用兩個平行樣品取平均值計算，各個條件下回收率的比較采用Origin 2018軟件進行分析。精密度選擇低、中、高三個濃度，每個濃度梯度取連續采集7針數據的峰面積進行相對標準偏差RSD值的計算。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

磺胺類抗生素的結構中含有氨基，容易結合H+，因此，采用正離子模式，以針泵連續進樣，首先得到24種磺胺類化合物的各個母離子，分別對其單標標準溶液（50 ng/mL）進行一級質譜掃描（Q1 MS）得到其母離子，然后對其進行子離子全掃描，選擇出兩個響應信號較強的碎片離子，其中響應值較高的為定量離子，另一個為定性離子，再將母離子和這兩個碎片離子組成檢測離子對，在MRM模式下優化去簇電壓（DP）和碰撞能（CE），優化結果如表1所示。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 色譜柱選擇 比較了ZORBAX Eclispse XDB-C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）、ZORBAX SBAq（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）、ZORBAX Eclispse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3款色譜柱對24種目標物的分離效果。實驗結果顯示，24種磺胺類抗生素在ZORBAX Eclispse Plus C18和ZORBAX SB-Aq色譜柱上分離度較差；相比而言，在ZORBAX Eclispse XDB-C18色譜柱上具有較好的分離效果且峰形尖銳，因此，選擇ZORBAX Eclispse XDB-C18色譜柱分離24種磺胺類抗生素。

2.2.2 流動相優化 流動相對目標物的保留時間和峰形存在一定的影響。考察了有機相為甲醇、乙腈，水相為水、0.1%甲酸水和2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）時的色譜分離效果。試驗結果顯示，乙腈相對于甲醇而言具有較好的分離度。當有機相和水相分別為乙腈、純水時，24種目標物的出現分裂縫且峰形較寬；加入甲酸后，峰形改善且分裂峰減少；而引入乙酸銨后導致磺胺硝苯的響應降低，因此，乙腈-0.1%甲酸水為最優流動相。圖1為24種磺胺類抗生素的總離子流色譜圖（TIC）。

圖1 24種磺胺類抗生素標準品的總離子流色譜圖（50 μg/L）Fig.1 Total ion chromatograms of 24 kinds of sulfonamides standards (50 μg/L)

2.3 前處理方法優化

2.3.1 提取劑的優化 由于樣品基質的復雜性，提取劑應滿足既能很好地溶解目標化合物，又能減少對雜質的萃取。乙腈和丙酮是QuEChERS法常用的提取劑，此外酸化乙腈對許多分析物具有良好的萃取效率[31]，因此，本實驗考察了3種提取劑（乙腈、0.5%酸化乙腈和丙酮）對24種磺胺類抗生素的提取效率。由圖2可知，相比于其他兩種提取劑，乙腈對24種磺胺類抗生素的回收率均能達到75.5%以上，而且乙腈可以很好地分離蛋白質和脂肪，降低雜質的干擾，因此，最終選擇乙腈作為提取劑。

圖2 不同提取劑對24種磺胺類抗生素回收率的影響Fig.2 Effect of different extractant on the recoveries of 24 sulfonamide antibiotics

2.3.2 凈化劑的優化 QuEChERS法是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的，其操作簡便、效率高、試驗成本低。QuEChERS法常用的凈化劑有PSA、C18、石墨化碳黑等。PSA可用于去除脂肪酸、糖類、有機酸和脂類等一些雜質，而C18能有效去除脂類[32]。本文比較了0.3 g PSA、0.3 g C18、0.3 g無水MgSO4+0.3 g PSA、0.3 g無水MgSO4+0.3 g C18對樣品的凈化效果（見圖3）。試驗數據顯示，以PSA或無水MgSO4+PSA作為凈化劑凈化時，15種磺胺類抗生素的回收率低于70.0%，特別是苯甲酰磺胺的回收率為7.3%，可能由于PSA對苯甲酰磺胺有較強的吸附作用。而以C18為凈化劑時，24種磺胺類抗生素的回收率整體較高，且無水MgSO4的加入能使24種目標物的回收率達到78%以上。在上述基礎上，進一步優化了C18和無水MgSO4的用量，當無水MgSO4為0.3 g時，比較了C18為0.2、0.3、0.4 g時對目標物回收率的影響。結果顯示，相比于其它用量，當C18為0.3 g時，24種磺胺類抗生素回收率較好，在79.0%～112.8%之間。固定C18用量為0.3 g，考察了0.2、0.3、0.4、0.5 g無水MgSO4對目標物回收率的影響。隨無水MgSO4用量的增加，24種磺胺類抗生素的回收率出現先升高再降低的趨勢，當加入無水MgSO40.4 g時，24種目標物的回收率最好。綜合上述結果，選擇0.3 g C18和0.4 g無水MgSO4作為凈化劑，24種磺胺類抗生素的回收率能達到84.2%～110.5%之間。

圖3 不同凈化劑對24種磺胺類抗生素回收率的影響Fig.3 Effect of different purification on the recoveries of 24 sulfonamide antibiotics

2.4 基質效應

標準曲線分別以基質空白和溶劑配制，根據基質效應計算公式：基質效應=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率×100[33]，當基質效應計算值在80.0%～120.0%時，可認為基質效應較弱，可忽略。結果表明，磺胺脒、磺胺二甲基異嘧啶、甲氧芐啶、磺胺醋酰、磺胺甲氧噠嗪、磺胺地索辛、磺胺苯吡唑的基質效應為41.5%～77.6%，具有明顯的基質抑制作用，而其它17種磺胺類抗生素的基質效應在82.0%～100.9%之間，基質效應較弱。為了能精準的定量分析，標準曲線采用基質空白提取液配制，以減少因基質效應引起的誤差。

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準曲線、檢出限和定量限 在優化的色譜和質譜條件下測定前述1.2部分配制基質匹配標準工作液，標準曲線的橫坐標為各目標化合物的濃度，縱坐標為定量離子對峰面積，得到線性回歸方程及相關系數（r），檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別以3倍和10倍的信噪比計算，見表2。這24種磺胺類抗生素的相關系數（r）均在0.999以上，線性關系良好，LOD和LOQ分別為0.01～0.48 μg/kg和0.02～1.59 μg/kg，能夠滿足定量分析的要求。

表2 24種磺胺類抗生素的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) for detection of 24 kinds of sulfonamides

2.5.2 加標回收率和精密度 在3個加標濃度分別為5、10和50 μg/kg下對空白樣品進行加標回收實驗，結果列于表3。24種待測物的平均回收率在80.0%～116.4%范圍內，相對標準偏差（RSD）為0.8%～9.4%，適用于魚肉制品中24種磺胺類抗生素殘留的同步快速檢測。

表3 24 種磺胺類抗生素的加標回收率及相對標準偏差（n=7）Table 3 Spiked recoveries and RSD of 24 sulfonamides (n=7)

2.6 實際樣品測定

在市內超市采集4份魚罐頭、2份魚腸、5份魚豆腐、4份魚丸、1份魚皮等16份實際樣品，利用本文所建立的超高效液相色譜-串聯質譜法對上述樣品中24種磺胺類抗生素殘留進行檢測，16份實際樣品均未檢出磺胺類抗生素。

3 結論

采用QuEChERS前處理技術，首次建立了魚肉制品中24種磺胺類抗生素的超高效液相色譜-串聯質譜法檢測新方法。24種目標物在各自線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.999，在3個加標濃度水平下的平均加標回收率為80.0%～116.4%，相對標準偏差（RSD）為0.8%～9.4%，檢出限和定量限分別為0.01～0.48 μg/kg和0.02～1.59 μg/kg。本方法前處理簡便、準確度和精密度高、靈敏度好，適用于魚肉制品中24種磺胺類抗生素的同步快速檢測，為開展魚肉制品中磺胺類抗生素的監測提供了技術支持，進一步保障了魚肉制品的質量。