NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果細胞壁代謝的影響

王 雪，李 乾，劉彩紅，古麗丹·塔勒達吾，劉鳳蘭，馮作山，王 靜,

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟林研究所，新疆 烏魯木齊 830063）

枸杞（Lycium barbarumL.）屬于茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium Linn.），是多年生雙子葉落葉灌木[1?2]。目前，我國是全球枸杞產(chǎn)品生產(chǎn)和消費的最主要地區(qū)[3]。枸杞含有多種活性物質(zhì)，具有降血糖、抗衰老、增強免疫力、保護細胞等作用，是藥食兩用的進補佳品[4?5]。但是由于采后的枸杞仍然進行著正常的以呼吸為主導(dǎo)的新陳代謝活動，在果實成熟至衰老的生命歷程中呼吸速率不斷變化并出現(xiàn)呼吸高峰[6]，因此采后枸杞的貯藏品質(zhì)、抗病性等受到不同程度的影響[7]。有研究稱采后枸杞鮮果常溫下放置2～3 d便開始出現(xiàn)衰老軟化現(xiàn)象，導(dǎo)致果實品質(zhì)降低[8]。因此找到一個經(jīng)濟有效的延長枸杞鮮果貯藏期，提高貯藏品質(zhì)的保鮮方法顯得尤為重要。

目前關(guān)于枸杞鮮果保鮮的研究報道主要集中于水楊酸處理[9]、水楊酸結(jié)合氣調(diào)處理[10]、殼聚糖涂膜處理[11?13]及保鮮膜處理[14]等，但采用NO熏蒸枸杞鮮果保鮮的研究報道尚不多見。NO是一種小分子氣體，適宜濃度的NO具有延緩果蔬組織成熟衰老、減輕冷害癥狀和控制采后病害等作用，近年來已廣泛應(yīng)用于芒果、李、甜瓜、蓮霧、桃、草莓等果蔬保鮮中。有研究報道，NO處理采后果蔬能較好地維持其硬度，保持果蔬較好的貯藏品質(zhì)[15?17]。另有研究顯示，NO熏蒸處理有效維持甜瓜果實采后硬度、減緩可溶性果膠質(zhì)量分數(shù)的上升，降低多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、纖維素酶的活力[18]。NO處理延緩貯藏過程中的采后枇杷[19]、蓮霧[20]、草莓[21]和番木瓜[22]細胞壁解聚進程，抑制果實細胞壁代謝相關(guān)酶活力，減慢原果膠和半纖維素分解速率，對保持果實的品質(zhì)產(chǎn)生積極作用。但NO熏蒸枸杞鮮果對細胞壁代謝影響的研究尚未見相關(guān)報道。

因此本試驗選用產(chǎn)自新疆博樂市的“寧杞七號”枸杞鮮果為試材，采用300 μL/L的外源NO氣體熏蒸枸杞，探究經(jīng)NO熏蒸枸杞鮮果軟化與細胞壁的關(guān)系，以期為外源NO熏蒸在抑制枸杞鮮果軟化方面的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“寧杞七號”枸杞 2019年7月3日采摘自新疆博樂市精河縣托里鄉(xiāng)，帶果柄和萼片采摘，在當(dāng)?shù)?±0.5 ℃冷庫中預(yù)冷24 h，裝框運送至新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)3±0.5 ℃冷庫，挑選無腐爛、發(fā)霉及遭受機械損傷的枸杞鮮果16 kg作為試驗原料（處理和對照各8 kg）；3,5-二硝基水楊酸 上海科峰實驗有限公司；結(jié)晶酚

天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；亞硫酸鈉、p-硝基苯酚 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉 天津市光復(fù)精細化工研究所；一水合檸檬酸、二水合檸檬酸鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水楊苷 上海素培生物科技中心；碳酸鈉 天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；p-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷 索萊寶公司；咔唑 上海化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 天津市鑫鉑特化工有限公司；所有試劑均為分析純。

D3024R冷凍離心機 上海珂淮儀器有限公司；PTT-A+200電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋、FL-1可調(diào)式封閉電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；752 N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞鮮果的處理方法 樣品處理前一晚使用酒精對熏蒸罐進行密閉消毒12 h，并于熏蒸前4 h打開熏蒸罐散去酒精氣味。待酒精氣味散去之后進行抽真空處理，在體積為26 L的熏蒸罐內(nèi)注入NO純度為99.9%的標(biāo)準(zhǔn)氣體，使用300 μL/L NO室溫熏蒸3 h，每罐處理枸杞鮮果2 kg。處理后的枸杞使用帶孔塑料筐盛裝，每框約2 kg（不超過塑料筐的三分之一），并在上方覆蓋報紙，立即放置3 ℃低溫冷庫進行貯藏，每6 d取樣一次，共取7次樣。

1.2.2 腐爛率的測定 采用觀察法，當(dāng)果實表面發(fā)生腐爛或有肉眼可見的腐爛菌斑即視為腐爛果。隨機取100枚枸杞鮮果，數(shù)出所有發(fā)霉腐爛果實個數(shù)，計算腐爛率。

1.2.3 硬度的測定 隨機取50枚果實，使用TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀測定枸杞硬度。測試方法：去果實赤道部相對兩面的皮，全質(zhì)構(gòu)分析TPA；探頭：P/36 R柱形探頭；測試目標(biāo)模式：應(yīng)變；壓縮程度：70%；測前速：2 mm/s；測中速：1 mm/s；測后速：1 mm/s；單位：N。

1.2.4 果膠物質(zhì)含量的測定 采用咔唑比色法[23]測定果膠物質(zhì)含量，內(nèi)容稍作改動。將20 g枸杞鮮果打漿，從中稱取1 g直接倒入10 mL離心管中，添加95%乙醇約至離心管8 mL處，將其放于沸水浴中加熱1 h，同時在加熱過程中及時補加95%乙醇。取出冷卻至室溫，于25 ℃、8000 r/min條件下離心30 min，留沉淀，加95%乙醇約離心管8 mL處，以上步驟重復(fù)4次。然后將沉淀放入原試管中，加入20 mL蒸餾水，在50 ℃水浴中保溫30 min，以溶解果膠。取出冷卻至室溫后，將上清液移入100 mL容量瓶中，用少量水洗滌沉淀，離心后，一并將上清液移入到容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此溶液即為可溶性果膠。

經(jīng)蒸餾水洗滌后的沉淀物，仍保留在原刻度離心管中，再向離心管中加入0.5 mol/L硫酸溶液5 mL，沸水浴中加熱1 h以水解原果膠。取出冷卻至室溫后，25 ℃、8000 r/min條件下離心15 min。上清液倒入100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，此為原果膠測定液。

取25 mL刻度試管，加入1 mL原果膠提取液/1 mL可溶性果膠提取液（稱取10.5 g NaCl，用50 mmol/L、pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液溶解，稀釋至100 mL，搖勻）和6 mL濃硫酸，沸水浴20 min，冷卻至室溫，加入0.2 mL咔唑乙醇溶液（1.5 g/L）（稱取0.15 g咔唑加入無水乙醇溶解并稀釋至100 mL），暗處反應(yīng)30 min，于530 nm處測定反應(yīng)液吸光度值。

式中，m′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0028X-0.0009）查得的半乳糖醛酸質(zhì)量，μg；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 多聚半乳糖醛酸酶活力的測定 采用比色法[23]測定多聚半乳糖醛酸酶（PG）活力，內(nèi)容稍作改動。將20 g枸杞鮮果打漿，從中稱取10 g與95%的預(yù)冷乙醇一起加入離心管中，搖勻，低溫靜置。10 min后離心20 min（12000 r/min、4 ℃），留沉淀，加入80%預(yù)冷的乙醇，重復(fù)上述操作。留沉淀加入8 mL提取緩沖液，4 ℃條件下靜置20 min，離心，上清液為PG提取液。

剩余步驟嚴格按照曹建康PG活力測定進行。

式中，m′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.5075X+0.0046）查得的葡萄糖質(zhì)量，mg；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；t—酶促反應(yīng)時間，h；m—樣品質(zhì)量，g；1.08—葡萄糖換算成半乳糖醛酸的系數(shù)（194/180）。

1.2.6β-半乳糖苷酶活力的測定 采用曹建康等[23]的測定方法測定β-半乳糖苷酶（β-Gal）活力。取0.5 mL p-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷溶液（5 mmol/L）和0.5 mL酶提取液于試管中，在37 ℃水浴中保溫30 min。取出后立即向試管中加入2 mL碳酸鈉溶液（1 mol/L）以終止酶促反應(yīng)，充分搖勻冷卻，于波長400nm處測定混合液的吸光值。

式中，m′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.18X+0.0114）查得的p-硝基苯酚物質(zhì)的量，μmol；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；t—酶促反應(yīng)時間，h；m—樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 纖維素酶活力的測定 采用曹建康等[23]的測定方法測定纖維素酶（Cx）活力。兩支25 mL試管中均加入1.5 mL羧甲基纖維素鈉溶液（10 g/L）和0.5 mL酶提取液，但其中一支試管中的酶提取液須經(jīng)過沸水煮5 min處理。恒溫水浴（37 ℃）1 h后直接加入3,5-二硝基水楊酸1.5 mL，沸水煮5 min，冷水中快速冷卻至室溫，加蒸餾水至25 mL處。540 nm處測定前充分搖勻。

式中，m′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.5075X+0.0046）查得的葡萄糖質(zhì)量，mg；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；t—酶促反應(yīng)時間，h；m—樣品質(zhì)量，g。

1.2.8β-葡萄糖苷酶活力的測定 采用水楊苷水解法[23]測定β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活力，內(nèi)容稍作改動。將20 g枸杞鮮果打漿，從中稱取10 g與95%的預(yù)冷乙醇一起加入離心管中，充分搖勻，低溫放置10 min，然后在4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min。留沉淀，加入10 mL提前預(yù)冷的80%乙醇，振蕩，低溫放置10 min，4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min。留沉淀，加入5 mL提前預(yù)冷的緩沖液，低溫放置20 min，同等條件下離心20 min，收集上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取1.5 mL水楊苷溶液（10 g/L）和0.5 mL酶提取液于25 mL具塞刻度試管中，在37 ℃水浴中保溫1 h。取出后，立即向試管中加人1.5 mL DNS試劑以終止酶促反應(yīng)，充分搖勻。然后在沸水浴中煮沸5 min，取出冷卻后，用蒸餾水稀釋至25 mL，充分混勻，在波長540 nm處測定。

式中，m′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.5075X+0.0046）查得的葡萄糖質(zhì)量，mg；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；t—酶促反應(yīng)時間，h；m—樣品質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上試驗均設(shè)定3個重復(fù)。試驗數(shù)據(jù)由Excel 2010進行整理，SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05、P<0.01分別表示差異顯著、極顯著，并用Origin 2018進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果腐爛率的影響

如圖1所示，在貯藏期間，果實的腐爛率呈上升趨勢，對照組和處理組果實分別在第12 d 和24 d開始出現(xiàn)明顯腐爛，且NO處理組的腐爛率極顯著（P<0.01）低于對照組，貯藏第36 d時對照組和NO處理組腐爛率分別為84.0%和38.0%，對照組腐爛率是NO處理組的2.21倍。說明NO熏蒸可以延緩果實腐爛的發(fā)生，后期可以抑制腐爛率的上升。

圖1 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果腐爛率的影響Fig.1 Effect of NO fumigation on rotting rate of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.2 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果硬度的影響

枸杞果實硬度下降通常表現(xiàn)為口感發(fā)粘，果實從堅挺狀態(tài)變?yōu)樗缮顟B(tài)，導(dǎo)致軟化。軟化程度較高必然引起微生物侵染，造成腐爛。由圖2可知，貯藏0～6 d，兩組的枸杞硬度均呈現(xiàn)急速下降趨勢，其中對照組果實硬度下降速度較快；貯藏6～36 d，對照組果實硬度快速下降，NO處理組呈現(xiàn)小幅度波動且在第36 d極顯著（P<0.01）上升，究其原因可能是因為纖維素對細胞壁骨架起到了重要的支撐作用，延緩了果實軟化；但自貯藏開始至結(jié)束，NO處理組硬度一直高于對照組枸杞，處理組和對照組枸杞硬度較起始點分別下降0.3 N和5.2 N，同時處理組的腐爛率極顯著（P<0.01）低于對照組，該結(jié)論與郭芹等[24]研究結(jié)果相似。說明NO熏蒸可以顯著抑制貯藏期間枸杞鮮果硬度下降，降低腐爛。

圖2 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果硬度的影響Fig.2 Effect of NO fumigation on firmness of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3 NO處理對冷藏枸杞鮮果細胞壁代謝的影響

2.3.1 果膠物質(zhì)含量

2.3.1.1 NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果原果膠含量的影響 果膠類物質(zhì)存在于胞間，起粘合聯(lián)結(jié)作用，果實成熟軟化時發(fā)生明顯變化，其結(jié)構(gòu)改變也是導(dǎo)致果實硬度發(fā)生變化的主要原因[25?27]，原果膠為非水溶性物質(zhì)，含量越高，果實越堅挺。由圖3可知，在整個貯藏過程中，對照組枸杞原果膠含量大致呈先上升后下降趨勢，貯藏36 d原果膠含量較第0 d低8.99%；與對照組相比，NO處理組枸杞原果膠含量變化幅度較小，且處理組枸杞原果膠含量始終高于對照組；貯藏第6 d，處理組枸杞原果膠含量達到最高值；6～12 d，原果膠含量有所下降；12～36 d，原果膠含量基本沒有變化；貯藏第36 d原果膠含量僅僅比貯藏第12 d低8.77%，較貯藏第0 d高18.77%。由此說明，NO熏蒸可有效保持冷藏枸杞鮮果原果膠含量，防止果實軟化。

圖3 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果原果膠含量的影響Fig.3 Effect of NO fumigation on the content of protopectin of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.1.2 NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果可溶性果膠含量的影響 細胞壁中可溶性果膠為水溶性物質(zhì)，其含量上升是果實軟化的主要原因之一[28]。由圖4可知，整個貯藏過程中對照組枸杞中可溶性果膠含量一直高于處理組；在貯藏第36 d效果極顯著（P<0.01），且處理組枸杞可溶性果膠含量比對照組低51.3%，究其原因可能是NO氣體熏蒸可抑制枸杞果實細胞壁中原果膠的降解，延緩可溶性果膠的生成，從而維持果實細胞壁結(jié)構(gòu)完整性，延緩果實硬度下降速度，這與NO抑制木瓜軟化結(jié)論相似[22]。由此說明，NO熏蒸可以抑制枸杞中可溶性果膠含量上升速率，維持枸杞鮮果貯藏過程中的質(zhì)地。

圖4 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果可溶性果膠含量的影響Fig.4 Effect of NO fumigation on soluble pectin content of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2 細胞壁代謝相關(guān)酶

2.3.2.1 NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果多聚半乳糖醛酸酶（PG）活力的影響 果膠類物質(zhì)中的原果膠向可溶性果膠的轉(zhuǎn)化速度與果膠酶類活性密不可分。由圖5可知，貯藏0～36 d，兩組枸杞鮮果PG活力均大致呈下降趨勢，且處理組枸杞PG活力始終低于對照組。貯藏0～12 d，對照組與處理組鮮果PG活力迅速下降，第12 d時分別比貯藏第0 d時低43.37%和45.80%。自12 d至貯藏結(jié)束，兩組枸杞鮮果均在貯藏第18 d和30 d出現(xiàn)酶活力高峰，且對照組分別高于處理組8.2%（P>0.05）和26.94%（P<0.01）。貯藏第30 d，兩組枸杞均出現(xiàn)酶活力高峰，其中對照組PG活力極顯著高于處理組（P<0.01），同期對照組原果膠含量出現(xiàn)較低值，并極顯著低于處理組（P<0.01）（圖3）；說明NO處理可能通過降低果實PG基因的表達[29]，抑制冷藏枸杞鮮果PG活力上升，緩解果實中原果膠向可溶性果膠的轉(zhuǎn)化速率，降低腐爛。

圖5 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果PG活力的影響Fig.5 Effect of NO fumigation on PG activity of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2.2 NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果β-半乳糖苷酶（β-Gal）活力的影響β-Gal可以使果膠降解或溶解，由圖6可知，在整個貯藏過程中，兩組枸杞鮮果的β-Gal活力大致呈下降趨勢，且處理組β-Gal活力始終低于對照組。貯藏18～36 d，處理組枸杞鮮果β-Gal活力低于對照組，且后期表現(xiàn)更加明顯。貯藏結(jié)束時，處理組β-Gal活力極顯著低于對照組（P<0.01），該現(xiàn)象與果實原果膠和可溶性果膠變化趨勢相對應(yīng)（圖3～圖4）。表明NO熏蒸降低了β-Gal活力，抑制原果膠物質(zhì)的轉(zhuǎn)化速度，緩解細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對降低腐爛有一定的作用。

圖6 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果β-Gal活力的影響Fig.6 Effect of NO fumigation on the activity of β-gal of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2.3 NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果纖維素酶（Cx）活力的影響 果蔬采后硬度下降導(dǎo)致軟化現(xiàn)象主要與其品種、呼吸強度、細胞壁代謝、糖代謝等多種因素相關(guān)[29?33]。有研究報道，細胞壁總體結(jié)構(gòu)的改變是果實軟化的重要原因之一[34]。細胞壁是一種“纖維素-半纖維素-果膠”組成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[22]。纖維素對細胞壁骨架起到了重要地支撐作用，纖維素結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致植物細胞壁變薄，硬度下降，果實軟化[35?37]。Cx可降解細胞壁中的纖維素，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)。由圖7可知，對照組與處理組枸杞Cx活力變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)“降-升-降-升”的趨勢。其中貯藏12～36 d處理組Cx顯著低于對照組（除24 d之外）。兩組枸杞Cx酶活力均在第18 d達到高峰，且對照組酶活力顯著高于處理組（P<0.05）；貯藏18～36 d，兩組鮮果酶活力先快速下降又迅速升高，在貯藏末期（30～36 d）對照組枸杞Cx活力極顯著高于處理組（P<0.01），與朱樹華使用NO處理草莓結(jié)果相似[38]，可能是因為NO通過影響Cx的pH，從而引起Cx構(gòu)象和和生理功能發(fā)生改變[39]。由此說明，NO熏蒸對于抑制冷藏枸杞鮮果Cx活力上升具有一定效果。

圖7 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果Cx活力的影響Fig.7 Effect of NO fumigation on Cx activity of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2.4 NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活力的影響β-Glu屬于纖維素酶類，對果實細胞壁的降解與穩(wěn)定產(chǎn)生重要影響[23?24]。Cx和β-Glu參與細胞壁中纖維素糖化，最終將纖維素水解成葡萄糖，細胞壁結(jié)構(gòu)瓦解，果實軟化，腐爛發(fā)生。由圖8可知，對照組枸杞鮮果呈先上升后下降的趨勢，其中在藏第30 d出現(xiàn)活力高峰。相較于對照組，處理組酶β-Glu活力上升趨勢更緩慢，且在第12、18和30 d顯著低于對照（P<0.05）。說明，NO熏蒸在不同貯藏時期抑制β-Glu活力的上升作用表現(xiàn)不同。

圖8 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果β-Glu活力的影響Fig.8 Effect of NO fumigation on the activity of β-Glu of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

3 結(jié)論

本試驗研究結(jié)果表明，在3±0.5 ℃的貯藏條件下，外源NO熏蒸處理可通過抑制枸杞鮮果PG、β-Glu、β-Gal和Cx活力，維持較高的原果膠含量，保持果實細胞壁結(jié)構(gòu)完整性，顯著（P<0.05）延緩了硬度的下降，抑制果實腐爛率的上升。說明NO熏蒸在抑制果實細胞壁代謝相關(guān)酶活力，保持果實品質(zhì)，延緩果實成熟軟化方面發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果將為外源NO熏蒸在枸杞鮮果保鮮方面的應(yīng)用提供理論參考。