酸棗提取物的抗氧化及抗衰老作用

葉曉楠，曾慧慧，劉思琦，李毅翔，黃莉莉，于 爽，李廷利，王艷艷,

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

酸棗（Ziziphus jujubaMill. var.spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou）是鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟果實，為藥食同源的中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，曰：“酸棗，味酸平，主心腹寒熱，邪結(jié)氣聚，四肢酸痛，濕痹，久服安五臟，輕身延年[1]”，這是古代醫(yī)籍中有關(guān)于酸棗延年益壽的最早記載?，F(xiàn)代藥理學研究表明，酸棗中富含大量三萜及其皂苷類[2]、黃酮類[3]、糖類[4]、氨基酸類[5]等化學成分，具有鎮(zhèn)靜催眠[6]、調(diào)節(jié)免疫[7]、保肝[8]、抗氧化[9?12]等多種生物活性。酸棗不同器官包括果實、果皮、果肉和種仁部位的提取液均被證實有清除羥自由基的作用[9]，目前酸棗已被廣泛加工制成酸棗酒[13]、酸棗醋[14]、酸棗汁[15]等食品，然而有關(guān)于其體內(nèi)抗氧化活性以及延緩衰老相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少。

本研究通過DPPH法、羥自由基法、Fe3+還原能力法測定酸棗提取物的體外抗氧化活性，并進一步利用果蠅這一模式生物，研究其對果蠅壽命和抗氧化酶活性的影響，從體外和體內(nèi)兩個角度，探討酸棗提取物抗氧化和抗衰老作用，為酸棗提取物的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型Canton S黑腹果蠅 中國科學院上海生命科學院提供；酸棗果實 產(chǎn)自山西陽泉，選取完整、大小均一、無蟲蝕、無損傷的果實，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院王振月教授鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟果實；水溶性維生素C 中國藥品生物制品檢定所；DPPH Sigma公司；蔗糖 天津市科密歐化學試劑有限公司；瓊脂 北京Biotopped科技公司；丙酸 天津致遠化學試劑有限公司；酵母粉

安琪酵母股份有限公司；硫酸亞鐵 天津市恒興化學試劑制造有限公司；水楊酸 天津巴斯夫化有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸 天津永晟精細化工有限公司；以上試劑均為分析純；FRAP檢測試劑盒 碧云天生物科技有限公司；羥自由基、SOD、CAT、MDA測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

MS204S分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Synergy MX酶標儀 BIOTEK公司；N-1100D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-1200冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司；CY600恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；D27超聲波清洗機 GT SONIC公司；果蠅二氧化碳麻醉裝置 自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗提取物的制備 依據(jù)實驗室前期研究基礎(chǔ)，用體積分數(shù)為50%的乙醇進行提取，乙醇和酸棗的液固比為22:1（mL/g），超聲（450 W，50 ℃）提取90 min，過濾，取濾液，濃縮，?40 ℃ 15 Pa冷凍干燥84 h，得酸棗提取物凍干粉備用。其中，總黃酮得率為2.31%、總酚得率為1.98%、多糖得率為18.50%，總皂苷得率為12.62%。

1.2.2 酸棗提取物體外抗氧化活性的測定

1.2.2.1 酸棗提取物對DPPH自由基清除能力的測定 用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的酸棗提取物樣品和VC溶液。取不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液各0.7 mL，加入1.3 mL 0.3 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光反應(yīng)完全后在波長517 nm處測定混合物的吸光度值[16?18]。

式中：A0為空白對照吸光度值，A1為樣品溶液吸光度值，A2為無水乙醇與樣品溶液吸光度值。

1.2.2.2 酸棗提取物對羥自由基清除能力的測定用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的酸棗提取物樣品和VC溶液。在反應(yīng)體系中依次加入0.2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和水楊酸-乙醇溶液，再加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和VC溶液各0.2 mL，0.2 mL 6 mmol/L的雙氧水溶液，于37 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)完全后在波長510 nm處測定混合物的吸光度值[19]。

式中：A0為空白對照吸光度值，A1為樣品吸光度值，A2為不加水楊酸-乙醇溶液的樣品本底吸收。

1.2.2.3 酸棗提取物對Fe3+還原能力的測定 用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的酸棗提取物樣品和VC溶液。取不同質(zhì)量濃度樣品溶液和VC溶液各0.2 mL，分別加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各1.0 mL，在50 ℃條件下反應(yīng)20 min，冷卻，加入10%三氯乙酸溶液0.8 mL，混勻，3000 r/min，離心5 min，取0.5 mL上清液，加入蒸餾水0.5 mL和0.1% FeCl3溶液0.1 mL，反應(yīng)完全后在波長700 nm處測定混合物的吸光度值[20]。

1.2.3 酸棗提取物體內(nèi)抗衰老活性的測定

1.2.3.1 果蠅的培養(yǎng) 果蠅飼養(yǎng)在溫度（24±1）℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替的環(huán)境中?；A(chǔ)培養(yǎng)基的配制[21]：稱取蔗糖31 g、瓊脂3 g，加入到300 mL三蒸水中，加熱煮沸，再將42 g玉米粉加入到160 mL三蒸水中混勻后倒入煮沸的液體中，混合均勻，繼續(xù)加熱至混合溶液呈糊狀后停止加熱。室溫條件下放涼至70 ℃左右時，加入3 g酵母粉，3 mL丙酸，攪拌均勻，趁熱分裝至洗凈滅菌的培養(yǎng)指管中備用。含藥培養(yǎng)基的配制：參照預(yù)實驗結(jié)果，在制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基的過程中加入酸棗提取物0.55、2.73、5.45 g，分別折合藥物質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.5%、1.0%。給藥組飼喂含藥培養(yǎng)基，空白組飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基每5 d更換一次。

1.2.3.2 酸棗提取物對果蠅壽命的影響 收集剛羽化8 h內(nèi)未交配的雌、雄果蠅共800只，隨機分成4組，每組200只（雌雄各半），分別置于不同質(zhì)量分數(shù)的酸棗提取物（0.1%、0.5%、1.0%）含藥培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每日固定時間觀察記錄死亡的果蠅數(shù)，直到全部果蠅死亡（非正常死亡的果蠅不納入統(tǒng)計）。統(tǒng)計分析果蠅的平均壽命和最長壽命，最長壽命為每組最后10%果蠅的平均壽命，記錄每管果蠅的存活時間，并繪制生存曲線[22]。

1.2.3.3 酸棗提取物對果蠅逆重力爬行能力的影響

收集剛羽化8 h內(nèi)未交配的雌、雄果蠅共160只，隨機分成4組，即不同質(zhì)量分數(shù)酸棗提取物組（0.1%，0.5%，1.0%）與空白組，每組40只（雌雄各半）。在上述培養(yǎng)基中將果蠅分別培養(yǎng)至第10 d和第30 d時，進行果蠅逆重力爬行實驗。將待測果蠅轉(zhuǎn)移至測定管中，輕拍測定管使果蠅落在測定管底部，記錄在10 s內(nèi)爬升至8 cm的果蠅數(shù)，每組果蠅測5次，兩次測量之間間隔1 min[23]，按公式計算果蠅攀爬指數(shù)，攀爬指數(shù)越高，代表果蠅逆重力爬行能力越強。

1.2.3.4 酸棗提取物對果蠅抗氧化能力的影響 收集剛羽化8 h內(nèi)未交配的雌、雄果蠅共2400只，隨機分成4組，即不同質(zhì)量分數(shù)酸棗提取物組（0.1%，0.5%，1.0%）與空白組，每組600只（雌雄各半），分別培養(yǎng)于相應(yīng)質(zhì)量分數(shù)的含藥培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第10 d和第30 d時，每組果蠅用二氧化碳氣體麻醉300只（雌雄各半，25只/管），稱重并放在裝有液氮的研缽中研磨后，加入預(yù)冷的生理鹽水制備2%的組織勻漿液。在4 ℃條件下，3000 r/min，離心10 min，取上清液用生化法測定SOD、CAT活力及MDA含量[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以均值±標準差（Mean±SD）表示。采用GraphPad Prism 8.0和 IBM SPSS 26.0作圖和進行統(tǒng)計學處理，采用單因素方差分析，用LSD法進行兩兩比較，生存試驗采用Log-rank檢驗分析壽命的顯著性，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗提取物體外抗氧化活性實驗結(jié)果

2.1.1 DPPH自由基清除能力 DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的脂質(zhì)自由基，其乙醇溶液（或甲醇溶液）呈深紫色，當加入具有自由基清除能力的物質(zhì)時，DPPH的孤對電子被配對，溶液由紫色逐漸褪變?yōu)辄S色，而顏色褪變的程度與其接受電子的數(shù)量呈化學計量關(guān)系，因此可用于評價樣品的抗氧化能力[18]。由圖1可知，在0.05～1.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酸棗提取物對DPPH自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強，當質(zhì)量濃度達到1.00 mg/mL時，其清除能力為74.17%，且呈繼續(xù)上升的趨勢。VC在0.05～0.20 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其對DPPH自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加大幅增強，但當質(zhì)量濃度超過0.20 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除能力趨于平緩，不再繼續(xù)增強。當清除體系50%的DPPH自由基時，所需酸棗提取物的質(zhì)量濃度為0.44 mg/mL，而VC為0.07 mg/mL。

圖1 酸棗提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of extract from Ziziphus jujuba

2.1.2 羥自由基清除能力 過氧化氫與Fe2+反應(yīng)可產(chǎn)生羥自由基，在反應(yīng)體系中加入水楊酸可以與羥自由基反應(yīng)產(chǎn)生紫色化合物，當加入具有羥自由基清除能力的樣品時，可以使紫色化合物生成量減少，利用這一原理可以測定樣品對羥自由基的清除能力[18]。由圖2可知，在0.05～1.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與DPPH自由基清除能力相似，酸棗提取物對羥自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加，羥自由基的清除能力逐漸增強，呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。VC在0.05～0.60 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其對羥自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加大幅增強，當質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時，其羥自由基清除能力不再增強。雖然酸棗提取物在各質(zhì)量濃度下，羥自由基清除能力均較VC弱，但仍然具有很強的羥自由基清除效果。當清除體系50%的羥自由基時，所需酸棗提取物的質(zhì)量濃度為1.40 mg/mL，而VC為0.19 mg/mL。

圖2 酸棗提取物對羥自由基的清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of extract from Ziziphus jujuba

2.1.3 Fe3+還原能力 樣品或VC作為還原劑可將鐵氰化鉀體系中的Fe3+還原成Fe2+，而后者可與顯色劑反應(yīng)生成藍色化合物，將混合物置于700 nm波長下測定吸光度值，吸光度值越大，則樣品還原力越強[25]。由圖3可知，酸棗提取物對Fe3+還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加，呈緩慢增強的趨勢。VC在0.05～0.40 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對Fe3+還原能力大幅增強，當質(zhì)量濃度超過0.40 mg/mL時，其對Fe3+還原能力趨于平緩。DPPH自由基清除率、羥自由基清除率及Fe3+還原能力的測定是常用的評價物質(zhì)體外抗氧化能力的方法，酚類、多糖[4]、黃酮類[9,26]化合物已被研究證實具有較好的清除自由基能力和還原能力，酸棗提取物中富含大量的酚類、多糖和黃酮類成分，這些成分可能是其發(fā)揮體外抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 酸棗提取物對Fe3+的還原能力Fig.3 Fe3+ reduction ability of extract from Ziziphus jujuba

2.2 酸棗提取物的體內(nèi)抗衰老活性

2.2.1 酸棗提取物對果蠅壽命的影響 在明確酸棗提取物體外抗氧化活性的基礎(chǔ)上，進一步利用果蠅進行酸棗提取物體內(nèi)抗氧化活性研究。選擇果蠅這一模式生物是因為果蠅的生命周期短、繁殖能力強、易于飼養(yǎng)、雌雄易分辨，且果蠅與人類有著十分相似的致病基因和衰老基因，因此果蠅在抗衰老藥物活性篩選研究中占有重要的地位[27]。本研究通過制作含藥培養(yǎng)基的方式，研究酸棗提取物對自然衰老果蠅壽命的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸棗提取物可以在一定程度上延長雌、雄果蠅的壽命。與雌性空白對照組相比，1.0%酸棗提取物組雌果蠅平均壽命由43.91 d延長至48.13 d（P<0.01），延長了9.61%；酸棗提取物各質(zhì)量分數(shù)組雌果蠅的最長壽命均顯著延長（P<0.05或P<0.01）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，與空白組雌果蠅相比，1%酸棗提取物組雌果蠅的壽命顯著延長（P<0.01）。與雄性空白對照組相比，0.5%、1.0%酸棗提取物組雄果蠅的平均壽命分別由42.46 d延長至46.8、48.36 d（P<0.05或P<0.01），分別延長了10.23%、13.91%；酸棗提 取物各組雄果蠅的最長壽命均顯著增加（P<0.01），且呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，與空白組雄果蠅相比，0.5%與1%酸棗提取物組雄果蠅的壽命顯著延長（P<0.05、P<0.01）。酸棗提取物延長果蠅壽命的作用可能與其富含的黃酮類[26]、酚類[28]成分有著密切的聯(lián)系，實驗結(jié)果見圖4，表1。

圖4 酸棗提取物對果蠅壽命曲線的影響Fig.4 Effect of Ziziphus jujuba extract on lifespan curves of D. melanogaster

表1 酸棗提取物對果蠅壽命的影響Table 1 Effect of Ziziphus jujuba extract on the lifespan of D. melanogaster

2.2.2 酸棗提取物對果蠅逆重力爬行能力的影響果蠅逆重力爬行實驗是依據(jù)果蠅反趨地性行為的特點而設(shè)計的，攀爬指數(shù)可以從行為學角度反映其運動能力，隨著果蠅日齡的增加，其運動能力也會隨之降低[29]。由圖5分析得出，在第10 d時，僅0.5%酸棗提取物組雄性果蠅攀爬指數(shù)增高（P<0.01），當用含藥培養(yǎng)基飼喂至第30 d時，各不同質(zhì)量分數(shù)酸棗提取物組雌、雄果蠅的攀爬指數(shù)均有不同程度的提高（P<0.05或P<0.01），酸棗提取物可以顯著增強30日齡果蠅的攀爬能力，提示酸棗提取物可能對自然衰老果蠅的運動能力具有提升作用。

圖5 酸棗提取物對果蠅逆重力爬行能力的影響Fig.5 Effect of Ziziphus jujuba extract on the negative geotaxis ability of D. melanogaster

2.2.3 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)抗氧化能力的影響

2.2.3.1 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)SOD活力的影響SOD是一種抗氧化酶，可以清除自由基[30]。不同質(zhì)量分數(shù)酸棗提取物對雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活力的影響見圖6。在第10 d，與空白組相比較，0.5%、1.0%酸棗提取物組雄果蠅及1.0%酸棗提取物組雌果蠅的SOD活力顯著增強（P<0.05或P<0.01）；在第30 d，與空白組相比，1.0%酸棗提取物組雄果蠅及0.5%、1.0%酸棗提取物組雌果蠅SOD活力增強，經(jīng)統(tǒng)計學分析，具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。第10 d和第30 d的0.1%酸棗提取物組雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活力與空白組相比較，有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示給予酸棗提取物，可以增強雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活力，且呈現(xiàn)較好的劑量依賴性，但是在較低劑量時，對雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活力的影響較小。

圖6 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)SOD活力的影響Fig.6 Effect of Ziziphus jujuba extract on SOD activity in D. melanogaster

2.2.3.2 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)MDA含量的影響MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可作為機體脂質(zhì)過氧化程度的指標，其含量可間接反映細胞損傷程度[31]。不同質(zhì)量分數(shù)酸棗提取物對雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量的影響見圖7。在第10 d，與空白組相比較，1.0%酸棗提取物組的雌、雄果蠅體內(nèi)的MDA含量均顯著降低（P<0.05）。在第30 d，與空白組相比較，0.5%、1.0%酸棗提取物組雄果蠅與三個劑量酸棗提取物組雌果蠅體內(nèi)的MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），且30 d各組雌、雄果蠅的MDA含量均高于10 d組，說明MDA的含量會隨著果蠅日齡的增加而增加，不同質(zhì)量分數(shù)的酸棗提取物可以降低雌、雄果蠅體內(nèi)MDA的含量。

圖7 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)MDA含量的影響Fig.7 Effect of Ziziphus jujuba extract on MDA content in D. melanogaster

2.2.3.3 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)CAT活力的影響CAT是體內(nèi)另一種抗氧化酶，與SOD作用相似，均可清除體內(nèi)自由基，從而減少機體產(chǎn)生的過氧化物[31]。不同質(zhì)量分數(shù)酸棗提取物對雌、雄果蠅體內(nèi)CAT活力的影響見圖8。在第10 d，與空白組相比較，0.5%與1.0%酸棗提取物組雌果蠅體內(nèi)的CAT活力顯著增強（P<0.05），各質(zhì)量分數(shù)組雄果蠅體內(nèi)CAT活力未見明顯改變（P>0.05），提示酸棗提取物對較低日齡的雄果蠅體內(nèi)CAT活力影響較小。在第30 d，與空白組相比較，0.1%、1.0%酸棗提取物組雄果蠅與0.5%酸棗提取物組雌果蠅體內(nèi)的CAT活力顯著增強（P<0.05），說明不同質(zhì)量分數(shù)的酸棗提取物能夠提高果蠅體內(nèi)CAT活力。

圖8 酸棗提取物對果蠅體內(nèi)CAT活力的影響Fig.8 Effect of Ziziphus jujuba extract on CAT activity in D. melanogaster

3 結(jié)論

本研究采用了DPPH自由基清除率、羥自由基清除率及Fe3+還原能力的方法評價了酸棗提取物的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的酸棗提取物對DPPH自由基、羥自由基均有不同程度的清除作用，對Fe3+具有還原能力，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。在此基礎(chǔ)上，利用果蠅這一模式生物，通過制作含藥培養(yǎng)基的方式，探索了酸棗提取物對自然衰老果蠅壽命的影響，發(fā)現(xiàn)酸棗提取物可以在一定程度上延長雌、雄果蠅的平均壽命和最長壽命，說明酸棗提取物具有一定的抗衰老作用。酸棗提取物還可以顯著增強30日齡果蠅的攀爬能力，提示酸棗提取物可能對自然衰老果蠅的運動能力具有提升作用。此外，酸棗提取物不同質(zhì)量分數(shù)組果蠅SOD、CAT活力均有不同程度的升高，MDA含量降低，說明酸棗提取物對果蠅有一定的抗氧化效果。綜上所述，酸棗提取物具有較好的體內(nèi)外抗氧化能力和潛在抗衰老作用，其作用機制可能與提高抗氧化酶活性及抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生有關(guān)，該研究結(jié)果為酸棗提取物開發(fā)成為延緩衰老的中藥保健食品提供實驗依據(jù)。