樺褐孔菌子實體中三萜類化合物的研究進展

王 艷，苑宏博，董迎迎，李虹佳，趙 寧，辛嘉英,2，張蘭威

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.哈爾濱工業大學，化工學院食品科學與工程系，黑龍江 哈爾濱 150076）

樺褐孔菌是一種生物活性優良的藥食兩用真菌[1]，其自然生長環境主要分布在低緯度地區，如俄羅斯及中國東北部等。國內主要分布在黑龍江大小興安嶺、吉林長白山、內蒙古、山西等地[2]。雖然早在400年前就有關于樺褐孔菌入藥的記載，但是有關于樺褐孔菌的深入研究是在上世紀50年代末才開始的[3]。經過了近些年的開發研究，人們發現樺褐孔菌具有多種有利于人體的功能特性，美國、俄羅斯、日本、中國等國都有在進行褐孔菌功能特性的相關研究[4]。目前，關于樺褐孔菌的研究主要分為樺褐孔菌野生子實體及人工培養兩方面，因樺褐孔菌對土壤條件、森林類型、共生樹種要求較高[2]，故野生樺褐孔菌資源較為有限，樺褐孔菌的人工培養在近些年已成為許多研究人員極為關注的研究方向。樺褐孔菌中包含Fe、Mg、Ca等常量元素在內的無機元素足有22種[5]，這22種無機元素均對人體無毒害作用，在無機元素角度看樺褐孔菌制品具有足夠的食用安全性，且通過小鼠急性毒性試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、Ames試驗、小鼠精子畸形試驗、大鼠28 d喂養試驗及大鼠90 d喂養等試驗探究樺褐孔菌的毒性作用，也證實了樺褐孔菌具有食用安全性屬實際無毒級[6]。除上述無機元素外，樺褐孔菌中還具有多種功效成分如三萜類化合物、多糖類化合物、多酚類化合物、甾體等物質，其中，樺褐孔菌中的三萜類化合物是樺褐孔菌中的主要功效成分之一，因其具有抗癌、降血糖、抗氧化等功效[7]，而備受國內外醫藥及食品行業關注。各國學者也一直在探索開發樺褐孔菌三萜類化合物的新功能性。目前，我國的樺褐孔菌開發與利用程度仍較為落后，市場上多數還停留在利用樺褐孔菌菌塊泡水飲用階段，其中的功效成分未被有效利用，但隨著對樺褐孔菌三萜類化合物相關研究的進一步深入，樺褐孔菌三萜類化合物產業化的醫療產品與保健食品市場必然會得到大力的開發。故本文綜述了國內外對樺褐孔菌三萜類化合物的人工誘導生成、提取分離純化、結構及功能性研究等內容，以期對樺褐孔菌資源的開發、樺褐孔菌的產業化開發、樺褐孔菌的醫療產品及食用產品的開發提供參考。

1 人工誘導樺褐孔菌發酵高產三萜類化合物

樺褐孔菌的功效很大程度上來源于樺褐孔菌所含的功能性物質，三萜類化合物作為樺褐孔菌主要功效成分之一，具有很高的研究價值。因野外樺褐孔菌資源有限，人工誘導培養樺褐孔菌菌種產三萜類化合物是目前國內外極為關注的研究方向，基于靈芝等藥用真菌的誘導培養機制，對樺褐孔菌的誘導培養也在逐漸深入。近年來，國內外研究人員通過實驗發現還原樺褐孔菌野外生長條件并添加相關物質也可以使樺褐孔菌中的三萜類化合物產量增加。目前，關于樺褐孔菌三萜類化合物的誘導培養研究現狀見表1。

表1 樺褐孔菌三萜類化合物的誘導培養研究現狀Table 1 Research status of induction culture of triterpenoids from Inonotus obliquus

可以看出傳統的誘導劑如茉莉酸甲酯、脂肪酸、金屬離子等物質中，茉莉酸甲酯對樺褐孔菌三萜類化合物的誘導作用較好。樺褐孔菌宿主提取物及植物共生微生物提取物誘導劑中根瘤菌提取物的誘導作用最好。通過上表也可看出，目前樺褐孔菌三萜類化合物誘導實驗所測定的多為總三萜或者單種類三萜，對誘導前后三萜類化合物的種類與含量關系測定研究較少。除添加誘導劑外，紫外誘變也可篩選出高產三萜菌株，且可參考其他類似真菌的誘導發酵培養實驗，如同屬于纖孔菌的粗毛纖孔菌誘導發酵培養試驗一樣進行誘導劑篩選并復配[12]。

2 樺褐孔菌三萜類化合物提取與分離純化

2.1 樺褐孔菌三萜類化合物的提取

三萜類化合物的提取原理主要是利用其在不同的有機溶劑中溶解性的差別，進而甄選有機溶劑進行提取。提取方法主要有回流提取法、高壓脈沖法、超聲提取法等，每種方法的提取效率與三萜類化合物得率都不同。研究人員對提取方法參數進行調整以期提高每種方法三萜類化合物得率，經實驗后，采用回流提取法，提取時間為2.5 h、提取溶劑為異丙醇、料液比1:22，回流溫度80 ℃，提取三萜類化合物的最佳得率為1.13%[13]。采用超聲提取法，提取時間為15 min、提取溶劑為異丙醇、料液比1:30、超聲功率300 W、超聲30次，提取三萜類化合物的最佳得率為1.06%[14]。采用高壓脈沖法，提取時間為20 μs、提取溶劑為75%乙醇溶液、料液比1:30、電場強度50 kV/cm、脈沖數10、提取三萜類化合物的最佳得率為1.18%，且比同采用75%乙醇溶液作為提取溶劑的超聲波法、溶劑浸提法提取率高5%和8%[15]。采用回流提取法三萜類化合物得率較高，儀器簡單，但提取時間較長。超聲提取法提取較為快速，但三萜類化合物得率較低。高壓脈沖法能耗低、重復性好、效率高且提取速度快，但設備復雜昂貴[16]。因此，在工業生產及實驗室提取時建議根據所有設備及提取目的甄別方法。

為了提高三萜類化合物得率，超聲波輔助技術與其它提取方法聯用備受關注。經實驗人員將僅采用超聲波提取法[14]與超聲波輔助技術聯用雙水相體系提取法比較發現，采用超聲波輔助技術聯用雙水相體系提取三萜類化合物得率提高了12.94%[17]。另有研究人員利用超聲波輔助技術聯用回流提取法提取三萜類化合物，將三萜類化合物得率提高至1.42%[18]。但其未與聯用提取法前得率進行對比，故參考價值有限。但仍可以看出利用超聲波輔助技術聯用其他方法可有效提高三萜類化合物得率，工廠及實驗室在選用提取方法時可以進行有效參考，選取合適的輔助與提取技術提取樺褐孔菌三萜類化合物。

2.2 樺褐孔菌三萜類化合物的分離純化

無論是通過野外子實體還是人工培養菌種提取得到的三萜粗提物成分均較為復雜，未達到可直接利用的純度，因此，需要對三萜粗提物進行分離純化才能進行利用。目前，三萜類化合物的分離純化方法主要有高效逆流色譜法、柱層析反復分離法、大孔樹脂吸附法和高效液相色譜法等，其特點見表2。

表2 樺褐孔菌三萜類化合物分離純化方法表Table 2 Table of separation and purification methods of triterpenoids from Inonotus obliquus

樺褐孔菌三萜類化合物的分離純化對于樺褐孔菌實驗室研究與工業化生產均具有重要意義。其中，大孔吸附樹脂吸附法，因其具有不含交換基團、不溶于水、吸附量大、選擇性好、吸附速度快、可再生等優點，被研究人員廣泛用來進行樺褐孔菌三萜類化合物的分離純化。其中，AB-8和D101兩種樹脂常用來進行樺褐孔菌三萜類化合物的分離純化，研究人員對兩種樹脂進行了篩選，發現AB-8大孔樹脂較D101大孔樹脂更適合用于分離純化樺褐孔菌三萜類化合物[21]，而后有研究人員對AB-8大孔樹脂分離純化三萜類化合物進行了工藝優化，其分離純化純度可達85.13%，與純化前相比總三萜量提高了2.04倍[23]。為了尋找更適合進行樺褐孔菌三萜類化合物分離純化的樹脂，研究人員擴大了篩選范圍對5種常用的大孔吸附樹脂進行了篩選實驗，實驗結果也證實了AB-8樹脂是目前更適宜進行樺褐孔菌三萜類化合物分離純化的大孔吸附樹脂[24]。

除了大孔樹脂吸附法，在實驗室及工業生產過程中色譜法也是分離純化三萜類化合物常用且高效的方法[25]。盡管高效液相色譜及高效逆流色譜提取三萜類化合物的純度較高，但是因為大孔吸附樹脂分離純化法具有工藝簡單、操作簡便、成本低、產率高等優點，后者應用更加廣泛。對于純度要求較高的實驗室研究選用高效液相色譜及高效逆流色譜法比較合適，對于成本要求更高的工廠應用則選用大孔吸附樹脂分離純化法更為合適。目前，關于樺褐孔菌三萜類化合物分離純化的研究較少但仍在持續進行，希望可以篩選出更多的樺褐孔菌三萜類化合物分離純化法，根據不同目的去選擇相應的分離純化方法是推動樺褐孔菌三萜資源開發的重要一步。

3 樺褐孔菌三萜類化合物結構研究

樺褐孔菌中三萜類化合物是由多種三萜類化合物組合構成的，目前，對于樺褐孔菌三萜類化合物結構的研究主要集中在其三萜類化合物萜組成成分方面，研究樺褐孔菌三萜類化合物的結構與功能特性之間的關系是后續亟需深入研究的部分。對樺褐孔菌三萜類化合物結構的研究方法主要有化學法和波譜法。波譜法（紫外吸收光譜法UV，紅外吸收光譜法IR，核磁共振波譜法NMR，質譜法MS）因具有樣品用量少，精確度高以及分析時間短等優點，已逐步取代化學法，廣泛應用于有機化合物的結構鑒定。

3.1 樺褐孔菌三萜化合物的結構研究現狀

關于樺褐孔菌的結構研究，目前多通過分離純化后，對分離物的波譜數據采用紅外光譜、核磁共振等技術進行分析，從而研究其結構。目前，關于樺褐孔菌三萜類化合物的結構研究尚處在起步階段，與樺褐孔菌多糖的結構研究相比較為落后，對于分離出的三萜類化合物功能性研究也較為不足。各樺褐孔菌三萜類化合物的功能活性與其結構間的關系也尚未被探明，有研究顯示茯苓皮中的羊毛甾烷型三萜的16位或15位羥基、BC環上的雙鍵均與其對腫瘤細胞的毒性密切相關[26]，樺褐孔菌中也含有多種羊毛甾烷型三萜，其結構與功能性的關系可能與茯苓皮羊毛甾烷型三萜類似。樺褐孔菌醇是一種羊毛甾烷型三萜，且是樺褐孔菌所含三萜類化合物中研究較早的，也是三萜類化合物中功能活性研究較為明確的。有學者根據靈芝中的靈芝酸A和靈芝酸H抑制癌細胞的增殖作用與其3位、7位和15位的羥基取代有關，推測出如果化學修飾樺褐孔菌醇7位、15位和16位上的羥基也可增加樺褐孔菌醇的抗腫瘤作用[27]。目前，樺褐孔菌三萜類化合物結構研究還停留在結構鑒定階段，其結構與功能特性的關系研究還處在起步階段正在等待科研人員的繼續探索。

3.2 樺褐孔菌三萜類化合物的結構鑒定

國內外研究人員采用了不同的方法對樺褐孔菌三萜類化合物進行了結構鑒定，目前，對樺褐孔菌三萜類化合物的結構鑒定見表3。

表3 樺褐孔菌三萜類化合物結構鑒定表Table 3 Structure identification table of triterpenoids from Inonotus obliquus

表中結構鑒定結果不同可能與其分離條件和方法選擇有關，從表中可以看出分離手段較少則所鑒定出的三萜類化合物種類也相應會較少，因此，在進行結構分析時需要將樺褐孔菌三萜提取物采用多種分離方法進行分離，故建議在進行樺褐孔菌三萜類化合物結構鑒定時根據已有條件盡量選用多種分離手段。

4 樺褐孔菌三萜類化合物的功能性

樺褐孔菌三萜類化合物的功能性研究是樺褐孔菌研究的重要組成部分，樺褐孔菌資源的開發依賴于其功能性的相關開發，對樺褐孔菌三萜類化合物的功能性進行透徹的體外實驗及動物實驗乃至臨床試驗對樺褐孔菌資源的開發、樺褐孔菌的工業化生產具有重要意義。

4.1 抗癌作用

樺褐孔菌三萜類化合物的抗癌功效一直是樺褐孔菌三萜類化合物功能性研究中的熱點，有報道顯示樺褐孔菌提取物對正常細胞無毒性作用，相比較其他抗癌藥物可能會有更小的副作用[32]。樺褐孔菌三萜類化合物對于抗癌的作用主要是從抑制癌細胞增殖作用和使癌細胞凋亡作用兩個方向進行實驗的[33]。有實驗發現樺褐孔菌三萜類化合物濃度達到250 μg/mL時即可明顯抑制癌細胞的增殖，并隨著劑量加大其抑制性也隨之增加，其胞外三萜類化合物對癌細胞增殖的抑制性明顯高于胞內三萜類化合物[30]。有研究人員在其研究上用其他癌細胞進一步進行了驗證，證實了其結論并發現樺褐孔菌胞外三萜類化合物含量高于胞內三萜類化合物含量[34]。因此，樺褐孔菌胞外三萜類化合物在抗癌領域更有進一步研究的價值。為了研究樺褐孔菌三萜類化合物對癌細胞的凋亡作用，有研究通過樺褐孔菌三萜類化合物誘導不同p53狀態的人肺癌細胞，發現其可使人肺癌細胞裂解從而使其凋亡，以達到抗癌作用[35]。有實驗發現樺褐孔菌三萜類化合物中的抗癌作用物為白樺脂醇、栓菌酸、樺褐孔菌醇和羊毛甾醇[36]。為了更加貼近實際應用效果，有研究人員對樺褐孔菌三萜類化合物抗癌作用與抗癌藥物紫杉醇做了對照，實驗結果表示樺褐孔菌三萜類化合物對人宮頸癌細胞、人結腸癌細胞、白血病腫瘤細胞及小鼠淋巴細胞均有較強的細胞毒性[37]。總的來說，體外實驗證明了樺褐孔菌三萜類化合物具有一定的抗癌功能，但是活體實驗的缺乏使其抗癌性能的作用效果并不明確，未來需要研究人員進行動物實驗乃至臨床試驗才能準確驗證評估樺褐孔菌三萜化合物的抗癌功能性。

4.2 降血糖作用

據估計，2045年，全球糖尿病患者人數將增至7億[38]。糖尿病藥物的研發是目前醫療行業的熱點項目，也是廣大糖尿病患者的期望福音。市面上許多商家對樺褐孔菌冠以“天然胰島素”之名，有研究表示樺褐孔菌對Ⅱ型糖尿病大鼠具有降血糖作用[39]，但樺褐孔菌資源開發程度較低，其降血糖作用也只處在保健或者輔助治療階段，只有對樺褐孔菌的功效物質進行更準確的降血糖功能實驗之后才能夠更好地將樺褐孔菌資源應用于糖尿病的治療當中。研究人員根據市面上的降糖藥物阿卡波糖的降糖原理——抑制α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶活性使進食的碳水化合物分解成葡萄糖的時間延長[40]，對樺褐孔菌三萜類化合物的α-葡萄糖苷酶抑制率與α-淀粉酶抑制率進行了實驗，實驗發現其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有一定的抑酶活性，其中，白樺脂酸對α-葡萄糖苷酶的活性抑制IC50值為0.26 mg/mL，顯著低于降糖藥物阿卡波糖的活性抑制IC50值（0.37 mg/mL），樺褐孔菌萜D對α-淀粉酶的活性抑制IC50值為7.86 mg/mL，顯著低于降糖藥阿卡波糖IC50值（10.51 mg/mL）；其作用機制為樺褐孔菌三萜類化合物對α-葡萄糖糖苷酶產生了競爭性抑制，對α-淀粉酶產生了非競爭性與競爭性抑制混合抑制[41]。體外實驗的成功也希望可以為后續的樺褐孔菌三萜類化合物降血糖動物實驗及開發新型抗糖尿病藥物提供新的思考。

4.3 抗氧化作用

在日常生活中人體會持續產生氧化性自由基，當自由基在體內積累過多時，就會加速人體的衰老甚至引發心血管疾病。目前，關于樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化相關試驗較為匱乏，基本停留在體外抗氧化試驗上，通過體外實驗發現樺褐孔菌三萜類化合物可清除DPPH、ABTS、超氧化物和過氧自由基，并隨著其濃度的升高其清除自由基能力也隨之升高[17,42]，體外實驗的結果證明了樺褐孔菌三萜類化合物具有一定的提高抗氧化能力作用。有研究人員對于氧化損傷小鼠模型做了相關實驗，發現樺褐孔菌對氧化損傷具有一定保護作用，功效成分為樺褐孔菌醇[43]。目前，關于樺褐孔菌的抗氧化小鼠實驗較少且均是腹腔給藥，相對較為偏重于醫療行業的應用，其以食品方向進行的喂藥小鼠實驗較少[44?46]。因此，在樺褐孔菌三萜類化合物抗氧化能力小鼠實驗中應進行喂藥供藥，以期更好地應用于食品行業。近年來我國針對腦卒中所開發的藥物丁基苯酞就可有效提高細胞抗氧化活性，樺褐孔菌的抗氧化作用研究對于腦卒中開發新藥及醫美行業抗衰老等都具有很大的研究價值。

4.4 其他作用

樺褐孔菌三萜類化合物的功能性作用仍然處于不斷開發階段，研究人員們基于樺褐孔菌的免疫調節、抗炎、抗氧化和抗凋亡性能，正在拓展研究樺褐孔菌三萜類化合物的一系列新的功能特性，如神經保護作用、抗脫發作用、抑制一氧化氮合成逆轉內毒素和腫瘤壞死因子引起的低血壓、和肝保護作用[31,47?49]。樺褐孔菌也在從泡水飲用的保健食品一步步向治療疾病的醫藥產品進發，研究人員致力于將樺褐孔菌不同的功效成分應用于治療不同的疾病，并將不同的功能特性應用于預防各類疾病。樺褐孔菌三萜類化合物作為樺褐孔菌中含量最多的脂溶性化合物，提取價值高，功能特性優越，樺褐孔菌三萜類化合物的研究開發對推動樺褐孔菌的產業化、應用化、規模化將起到重要作用。

5 結語與展望

樺褐孔菌三萜類化合物具有抗癌、降血糖、消炎、抗氧化等多種功效，并基于以往研究的成果正在不斷研究、開發和應用于其他保健與醫療場景，對未來的保健品、藥品與食品行業的市場應用具有一定的啟發。因野生樺褐孔菌資源有限，大規模的樺褐孔菌三萜類化合物產品生產將更加依賴于人工培養樺褐孔菌，為促使樺褐孔菌資源的規模化發展，今后應系統化的對人工誘導培養出的樺褐孔菌菌株進行后續相應的提取、分離純化和功能特性的相關實驗并與野外子實體相關實驗數據進行比對，并在實驗室及工廠化兩個方面去進行提取及分離純化的技術篩選進而推動樺褐孔菌的規模化和產業化。

對樺褐孔菌三萜類化合物今后的研究方向，可以從以下幾個方面進行：a.目前樺褐孔菌三萜類化合物的誘導性高產研究多與單一刺激物或外源因子有關，復配誘導劑的有關研究相對較少，并可將復配誘導劑與物理誘變法相結合以期提高三萜化合物產量；b.目前缺少樺褐孔菌三萜類化合物對人體的作用研究，基本停留在體外實驗階段，動物實驗也較少，體外實驗的成果在人體上效果如何，是否有不良反應及禁忌尚未可知，應增加動物實驗比例并隨進度進行臨床試驗；c.尚未探明樺褐孔菌三萜類化合物的結構與其功能活性的關系，探明關系后多展開關于樺褐孔菌單體三萜化合物的功能性實驗及化學修飾，以期增加其功能性，推廣樺褐孔菌開發。

樺褐孔菌作為尚未廣泛應用于醫療及食品行業的新興研究真菌，與靈芝等真菌不同，盡管已經過了科研人員幾十年的不懈研究，但尚有許多作用機制尚未明確，大多數研究目前還停留在應用方面，對作用機制的研究較少。作用機制的明確對于樺褐孔菌的醫用食用安全性研究將起到很大地促進作用，并從臨床角度齊頭并進，才能更好地開發利用樺褐孔菌資源，為人類的生活質量與疾病治療做出貢獻。