超聲波輔助提取骨碎補總黃酮的工藝研究*

韋國蘭, 龍杰鳳, 白 鳳

骨碎補(Rhizoma Drynaria)為水龍科多年生蕨類植物槲蕨[Drynaria fortunei(Kunze)J. Sm. ]干燥根莖[1], 是骨傷科常用中藥材。 具有止痛、 補腎健骨的功效, 常用于腎虛腰痛, 耳鳴耳聾, 牙齒松動, 跌撲閃挫, 筋骨折傷[2]等。 骨碎補含有多種有效活性成分, 其中主要活性成分為黃酮類化合物, 其具有抗氧化、 抗炎、 鎮痛[3-5]、 神經保護作用[6-8]、 促進骨折愈合[9]、調節免疫[10]的作用。 鑒于此, 本試驗以骨碎補為原料, 以乙醇為提取溶劑, 采用超聲波輔助提取法對骨碎補中總黃酮進行提取工藝優化, 以期為骨碎補的進一步研究提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

骨碎補購于凱里市中藥材市場, 去雜后于烘箱中干燥至恒重, 再粉碎、 過80 目篩, 樣品粉末放入密封袋避光保存, 待用; 所用試劑為蘆丁、 亞硝酸鈉、 硝酸鋁、 氫氧化鈉、 甲醇等都為市售。

WGLL-230BE 電熱鼓風干燥箱, 天津市泰斯特儀器有限公司; FW400A 高速萬能粉碎機, 北京科偉永興儀器有限公司;JP-040 超聲波清洗機, 深圳市潔盟清洗設備公司; TD5M 低速離心機, 長沙湘智離心機儀器有限公司; UV-2550 紫外分光光度計, 島津企業管理中國有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線的制作參照文獻[11]: 準確稱取0.1260 g 蘆丁標準品于150 mL 燒杯中, 并用100 mL 的70%乙醇溶液溶解后轉移至1000 mL 容量瓶中, 并定容至刻度, 搖勻靜置。 分別吸取該標準溶液1.0 mL、 2.0 mL、 3.0 mL、 4.0 mL、 5.0 mL于5 個25 mL 比色管中, 再分別加入70%乙醇溶液至5.0 mL,混合均勻, 再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL, 混合均勻, 靜置6 min。 加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液, 混合均勻, 放置6 min,再加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液, 混合均勻。 放置15 min, 并于510 nm 波長處測定其吸光度。 以蘆丁濃度(X)為橫坐標, 吸光度(Y)為縱坐標, 繪制標準曲線。 其回歸方程為: Y=11.701X-0.0057(R2=0.9996)。 由此可見, 此方程線性良好。

1.2.2 骨碎補總黃酮得率的結果計算

總黃酮得率(%)=(C×V×稀釋倍數)×100% /M式中: C 為標準樣液濃度, mg/mL; V 為樣品體積, mL;M 為稱取樣品質量, mg。

1.2.3 單因素試驗1.2.3.1 乙醇濃度對骨碎補總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g 骨碎補粉末5 份, 放入相應的5 個250 mL圓底燒瓶中, 按固定料液比為1 ∶10 比例分別加入50%、60%、 70%、 80%、 90%濃度的乙醇, 用保鮮膜封口, 在溫度為40 ℃條件下超聲提取15 min 后放置室溫, 抽濾, 濾液轉入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根據1.2.1 測定其吸光度。

1.2.3.2 料液比對骨碎補總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g 骨碎補粉末5 份, 放入相應的5 個250 mL圓底燒瓶中, 以40%乙醇溶液為提取劑, 以按1∶5、 1∶10、1∶15、 1∶20、 1∶25 為料液比, 用保鮮膜封口, 在溫度為40 ℃條件下超聲提取15 min 后放置室溫, 抽濾, 濾液轉入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根據1.2.1 測定其吸光度。

1.2.3.3 提取時間對骨碎補總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g 骨碎補粉末5 份, 放入相應的5 個250 mL圓底燒瓶中, 按固定料液比為1∶10 加入70%的乙醇, 用保鮮膜封口, 在溫度為40 ℃條件下超聲提取時間依次為15 min、30 min、 45 min、 60 min、 75 min 后, 放置室溫, 抽濾, 濾液轉入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根據1.2.1 測定其吸光度。

1.2.3.4 提取溫度對骨碎補總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g 骨碎補粉末5 份, 放入相應的5 個250 mL圓底燒瓶中, 按固定料液比為1∶10 加入70%的乙醇, 設置超聲溫度分別為40 ℃、 50 ℃、 60 ℃、 70 ℃、 80 ℃, 超聲提取30 min 后, 放置室溫, 抽濾, 濾液轉入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根據1.2.3 測定其吸光度。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上, 采用L9(34)正交實驗優化提取工藝參數。 因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度對骨碎補總黃酮提取的影響

根據圖1 可知, 當乙醇濃度為50% ～70%之間, 骨碎補總黃酮得率隨乙醇濃度增大逐漸增大, 當料液比為70%時總黃酮得率最大, 隨后慢慢降低。 故正交試驗設計中選取提取乙醇濃度為60% ～80%。

圖1 乙醇濃度不同對總黃酮提取的影響Fig.1 Influences of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2 料液比對骨碎補總黃酮提取的影響

根據圖2 可知, 當料液比為1∶5 ～1∶15 之間, 骨碎補總黃酮得率隨料液比加大逐漸增大, 當料液比為1∶15 時總黃酮得率最大, 隨后慢慢降低。 故正交試驗設計中選取提取料液比為1∶10 ～1∶20。

圖2 料液比不同對總黃酮提取的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield

2.3 提取時間對骨碎補總黃酮提取的影響

根據圖3 可知, 當超聲提取時間為15 ～45 min 時, 骨碎補總黃酮得率隨提取時間增加而逐漸增大, 當超聲提取時間達45 min 時, 這時總黃酮得率最大, 60 min 后總黃酮得率逐漸降低。 故正交試驗設計中選取提取時間為30 ～60 min。

圖3 提取時間不同對總黃酮提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on total flavonoids yield

2.4 提取溫度對骨碎補總黃酮提取的影響

根據圖4 可知, 當提取溫度在40 ～70 ℃時, 骨碎補總黃酮得率逐漸增大, 當提取溫度達70 ℃時, 這時總黃酮得率最大,70 ℃后總黃酮得率逐漸降低。 故正交試驗設計中選取提取時間為60 ～80 ℃。

圖4 提取溫度不同對總黃酮提取的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids yield

2.5 骨碎補總黃酮提取工藝的優化

在單因素試驗結果的基礎上設計正交試驗方案, 選取各因素中骨碎補總黃酮得率較高三個水平進行正交試驗。 正交實驗結果見表2。

表2 正交試驗方案及結果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2 中極差分析可知, 影響骨碎補總黃酮提取效果的因素主次順序為: A(乙醇濃度)＞B(料液比)＞D(提取溫度)＞C(提取時間), 最佳工藝為A2B2C1D3, 即乙醇濃度為70%、料液比為1∶15、 提取時間為30 min、 提取溫度80 ℃。 從表2中可知, 在實際實驗的9 組試驗中骨碎補總黃酮提取效果最好的是第5 組試驗(A2B2C3D1), 故對A2B2C1D3進行驗證實驗,驗證實驗結果為總黃酮得率為7.53%, 得率稍大于第5 組試驗(A2B2C3D1), 由此證明A2B2C1D3骨碎補總黃酮提取的最佳工藝。

3 結 論

在單因素的基礎上, 采用正交設計對骨碎補總黃酮提取工藝進行優化, 得到骨碎補中黃酮的最佳提取工藝條件為:A2B2C1D3, 即乙醇濃度為70%、 料液比為1∶15、 提取時間為30 min、 提取溫度80 ℃。 此方法低成本、 快速, 可為骨碎補的開發利用提供一定理論依據。