載阿霉素PEG-PLGA 納米粒的制備及優化*

朱站站, 王紹仙, 王亞倫, 李婧煒

阿霉素(doxorubicin, Dox)作為一種臨床上有效的蒽環類抗腫瘤化療藥物, 能通過與DNA 堿基對之間相互作用并緊密結合到DNA 上, 進而抑制DNA 與RNA 的合成, 對肝癌、 胃癌、乳腺癌、 白血病等多種惡性腫瘤均具有良好的治療效果[1]。 但阿霉素可激活心肌細胞的氧化應激系統, 進而導致心肌細胞胞漿內ROS 上升, 引起心肌氧化應激損傷、 肌節蛋白結構破壞等[2-3], 具有明顯的心臟毒性, 嚴重時會進一步引起心力衰竭[4]。 這導致阿霉素在臨床應用上受到一定的限制, 如何降低阿霉素的體內毒副作用, 是提高阿霉素應用的關鍵問題。

近年來, 可生物降解的聚合物如納米粒、 脂質體, 等在腫瘤的治療方面被廣泛應用[5-6]。 PLGA 是一種可降解的高分子聚合物, 由于其具有良好的生物相容性, 可降解為人體的中間產物乳酸和羥基乙酸, 被廣泛應用于藥物載體的制備[7]。 PEG是最常用的納米粒表面改性的親水性化合物, 其不僅具有良好的生物相容性, 而且能夠在血液循環中有效的阻止納米粒子與血液中蛋白的結合[8-9], 提高納米粒子在血液中的穩定性, 延長納米粒子在體內的循環時間。 本文采用復乳溶媒蒸發法制備NP/Dox, 進一步對制備工藝進行優化, 并對NP/Dox 的粒徑、Zeta 電位、 包封率和載藥量進行測定, 為阿霉素的臨床應用提供了基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

BSA124S 電子天平, Sartorius 德國; MS7-H550-Pro 磁力攪拌器, 北京大龍興創實驗儀器有限公司; SCIENTZ-950E 超聲波細胞粉碎儀, 寧波新芝生物科技股份有限公司; HC-3018R高速冷凍離心機, 安徽中科中佳科學儀器有限公司; RE-2000A 旋轉蒸發儀, 上海亞榮生化儀器廠; YR-PTB 循環水真空泵, 上海亞榮生化儀器廠; SPD-M20A 高效液相色譜儀, 日本島津; Tecnai 透射電子顯微鏡, 美國Fei 公司; Bettersize2600E激光粒度儀, 丹東百特儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

Me-PEG-PLGA(MW: 50000), 山東岱罡生物科技有限公司; MAL-PEG-PLGA(MW: 60000)西安瑞禧生物科技有限公司; 膽酸鈉(25 g), 中國國藥集團化學試劑有限公司; 鹽酸阿霉素(D6900), 北京索萊寶科技有限公司; 二氯甲烷、 乙腈、磷酸、 甲醇均為分析純, 中國國藥集團化學試劑有限公司; 實驗用水均為超純水。

2 方法結果與討論

2.1 阿霉素的HPLC 體外含量檢測方法

色譜柱: Dikma Diamonsil C18(5 μm,200 mm×4.6 mm); 流動相: 磷酸緩沖液∶乙腈=65∶35; 流速: 1.2 mL/min; 進樣量: 20 μL; 檢測器: 島津RF-20A 熒光檢測器; 檢測波長:Ex=467 nm, Em=589 nm; 柱溫: 35 ℃。

2.2 標準曲線的制備

電子天平精密稱取50 mg 的阿霉素于50 mL 的容量瓶內,加入去離子水溶解后定容作為阿霉素的儲備液(1 mg/mL)。 在10 mL 容量瓶內, 取適量的阿霉素儲備液分別稀釋為0.01、0.1、 0.5、 1、 5、 10、 50 ng/mL, 分別取上述的不同濃度的阿霉素溶液20 μL 依次進行進樣分析, 每一濃度重復進樣三次,取峰面積的平均值A。 以HPLC 峰面積A 對阿霉素的濃度C(ng/mL)進行線性回歸得到標準曲線C= 0.0031A+0.1969,(R2= 0.9999), 線性范圍為0.01-50 ng/mL。

2.3 NP/Dox 載藥量包封率測定

采用HPLC 測定NP/Dox 的載藥量和包封率, 將NP/Dox 分為兩份, 其中一份用乙腈溶解, 然后加入甲醇稀釋, 按照“2.1” 色譜條件分析納米粒中阿霉素的含量, 另一份冷凍干燥后稱量得到NP/Dox 的總量。 按照以下公式計算得到NP/Dox的包封率和載藥量。

2.4 NP/Dox 的制備

采用電子天平稱取一定量的Me-PEG-PLGA 和MAL-PEGPLGA 的聚合物材料于1 mL 的二氯甲烷中, 使聚合物材料完全溶解。 向聚合物溶液中加入50 μL 一定濃度的鹽酸阿霉素水溶液, 超聲波細胞粉碎儀以60 W 的功率冰水浴間斷超聲1 min(超聲3 s, 間斷3 s), 隨后向得到的初乳中加入2 mL 的1 %的膽酸鈉水溶液, 再以固定功率冰水浴間斷超聲一定時間(超聲3 s, 間斷3 s)。 將超聲得到的乳液滴入20 mL 0.5%的膽酸鈉水溶液中, 磁力攪拌器攪拌10 min, 旋轉蒸發儀除去溶液中的二氯甲烷。 最后通過高速冷凍離心機收集納米粒(12000 rpm,4 ℃, 1 h), 用超純水清洗三次后冷凍干燥得NP/Dox。

2.5 超聲功率的優化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質量比為9∶1稱取聚合物總量為25 mg, 超聲的時間為1 min, 阿霉素的投料量為0.5 mg, 超聲的功率分別為80 W、 100 W、 120 W、 160 W,按照“2.4” 方法制備NP/Dox, 利用激光粒度儀測定其粒徑和Zeta 電位, 考察超聲功率對NP/Dox 的粒徑影響。 如表1 所示,隨著超聲功率的增大NP/Dox 的粒徑逐漸減小, 粒徑大小不僅影響納米粒的載藥量同時還影響著納米粒在體內的轉運。 納米粒的粒徑過大會降低細胞的吞噬效率, 不利于納米粒載體將藥物轉運至病灶部位。 當超聲功率達到160 W 時在超聲過程中出現沸騰現象, 致使超聲不均勻, 出現明顯分層現象, 因此選擇超聲功率為120 W。

表1 超聲功率對NP/Dox 粒徑和電位的影響Table 1 Effect of ultrasonic power on NP/Dox particle size and Zeta potential

2.6 超聲時間的優化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質量比為9 ∶1稱取聚合物總量為25 mg, 超聲的功率為120 W, 阿霉素的投料量為0.5 mg, 超聲時間分別為0.5 min、 1 min、 2 min。 按照“2.4” 方法制備NP/Dox, 利用激光粒度儀測定其粒徑和Zeta電位, 考察超聲時間對NP/Dox 的粒徑影響。 如表2 所示, 當超聲時間為0.5 min 時NP/Dox 的粒徑為178 nm 左右, 當超聲時間為1 min 和2 min 時NP/Dox 的粒徑為165 nm 左右。 當超聲時間為1 min 時NP/Dox 的Zeta 電位為-35 mV 左右, 更有利于保持納米的穩定。 因此選擇超聲時間為1 min。

表2 超聲時間對NP/Dox 粒徑和電位的影響Table 2 Effect of ultrasonic time on NP/Dox particle size and Zeta potential

2.7 聚合物的總量的優化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質量比為9 ∶1稱取聚合物總量為10 mg、 25 mg 和50 mg, 超聲的功率為120 W, 超聲時間為1 min, 阿霉素的投料量為0.5 mg, 按照“2.4” 方法制備NP/Dox, 利用激光粒度儀測定其粒徑和Zeta電位, 考察聚合物總量對NP/Dox 的粒徑影響。 結果如表3 所示, 隨著聚合物總量的增加, 納米粒的粒徑明顯增加。 納米粒的粒徑過大不利于藥物的轉運, 當納米粒載體的粒徑過小會大大降低納米遞藥系統的載藥量。 因此我們優化選擇聚合物總量為25 mg。

表3 聚合物總量對NP/Dox 粒徑和Zeta 電位的影響Table 3 Effect of total polymer on NP/Dox particle size and Zeta potential

2.8 阿霉素的投料量與聚合物總量的比例優化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質量比為9 ∶1稱取聚合物總量為25 mg, 超聲的功率為120 W, 超聲時間為1 min, 分別稱取0.5 mg、 1.0 mg 和1.5 mg 的阿霉素, 按照“2.4” 中的方法制備NP/Dox, 考察阿霉素的投料量與聚合物總量的質量比對NP/Dox 的載藥量和包封率的影響。 結果如表4 所示, 阿霉素的投料量與聚合物總量的質量比為4%和6%時, 其包封率偏低, 藥物的損失偏多, 當阿霉素的投料量與聚合物總量的質量比為2%時, 其藥物的包封率為68.3%左右,藥物的利用率高, 因此選擇Dox 的投料量與聚合物總量的質量比為2%。

表4 阿霉素投料量與聚合物總量的質量比對NP/Dox 的載藥量和包封率的影響Table 4 Effects of mass ratio of doxorubicin to total polymer on NP/Dox drug loading content and encapsulation efficiency

2.9 NP/Dox 的粒徑和Zeta 電位的測定

按照優化后的條件制備NP/Dox, 采用去離子水將NP/Dox稀釋。 采用激光粒度儀測定NP/Dox 的粒徑和Zeta 電位, 如表5、 圖1、 圖2 所示, NP/Dox 的粒徑為161.4 nm 左右, Zeta電位為-37.1 mV 左右。

表5 NP/Dox 的粒徑和Zeta 電位Table 5 The particle size and Zeta potential of NP/Dox

圖1 NP/Dox 的粒徑分布圖Fig.1 The particle size distribution of NP/Dox

圖2 NP/Dox 的Zeta 電位分布圖Fig.2 The Zeta potential distribution of NP/Dox

3 結 論

本研究通過復乳溶媒蒸發法成功制備了NP/Dox。 進一步優化超聲功率、 超聲時間、 聚合物總量對NP/Dox 粒徑的影響,阿霉素的投料量對NP/Dox 載藥量和包封率的影響, 確定了超聲功率為120 W、 超聲時間為1 min、 聚合物總量為25 mg, 阿霉素與聚合物的質量比為2%。 最終制備得到NP/Dox, 粒徑在161 nm 左右, PDI 在0.05 左右, Zeta 電位為-37.1 mV 左右,并具有較好的穩定性。