不同產(chǎn)地杠板歸總黃酮的含量測定*

黃桂坤, 趙婉云, 廖長秀, 王金妮, 徐靈源

杠板歸(Polygonum perfoliatumL. )又名貫葉蓼、 蛇牙草等,為蓼科植物杠板歸的干燥地上部分, 亦為西南地區(qū)少數(shù)民族常用藥物, 具有清熱解毒、 利水消腫、 止咳的功能[1]。 臨床用于腎炎水腫、 上呼吸道感染、 百日咳、 瀉痢、 濕疹、 癤腫、 毒蛇咬傷等[2-3]。 杠板歸植物中含黃酮類、 苯丙酸類、 蒽醌類、 甾體類、 萜類和酰胺類等多種化學(xué)成分。 其中黃酮類化合物為杠板歸的主要化學(xué)成分, 目前從杠板歸植物中分離提取的黃酮類化合物有二十多種, 有山萘酚、 槲皮素、 蓄苷、 槲皮素-3-Oβ-D-葡萄糖醛酸甲酯、 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯、 山萘酚-3-O-蕓香糖苷及蘆丁等[4]。 現(xiàn)代研究證明, 黃酮類化合物具有多種藥理活性, 可能為杠板歸的主要活性成分[5-6], 本實(shí)驗(yàn)通過對不同產(chǎn)地杠板歸總黃酮的含量進(jìn)行測定,為考察杠板歸的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材 料

杠板歸藥材, 不同產(chǎn)地購買或采集, 經(jīng)廣西食品藥品檢驗(yàn)所藥師黃清泉鑒定; 蘆丁對照品(批號100080-201409), 中國藥品生物制品檢定所提供, 供含量測定用; 三氯化鋁(批號:110818), 西隴化工股份有限公司; 乙酸鈉(批號: 170215),西隴科學(xué)股份有限公司; 水為純化水; 實(shí)驗(yàn)所用甲醇、 乙醇等試劑均為分析純。

1.2 儀 器

T6 型紫外-可見分光光度計(jì), 北京普析通用有限公司;SL1001N 型電子天平, 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;AN0527 型電子天平, 上海民析精密科學(xué)儀器有限公司; KQ-100E 型超聲波清洗器, 昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

杠板歸藥材粉碎, 過16 目篩, 取粉末1 g, 精密稱定, 置100 mL 具塞錐形瓶中, 精密加入70%乙醇25 mL, 稱定重量,超聲提取80 min, 取出, 放冷至室溫, 再稱定重量, 用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品5.1 mg, 置于20 mL 量瓶中, 用70%的乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即配成濃度為0.255 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 最大吸收波長的確定

參考張明等[7]研究法對杠板歸總黃酮進(jìn)行顯色, 以AlCl3-NaAc 為顯色劑, 與空白對照, 在300 ～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描, 發(fā)現(xiàn)杠板歸總黃酮與蘆丁對照品溶液共同的最大吸收波長為412 nm, 見圖1。

圖1 杠板歸總黃酮與蘆丁對照品吸收波長掃描圖Fig.1 Scanning chart of absorption wavelength of total flavonoids and rutin

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取蘆丁對照品溶液0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0 mL 置于10 ml 容量瓶中, 分別精密加入1 mol/L NaAc 溶液4 mL 與0.1 mol/L AlCl3溶液3 mL 進(jìn)行顯色, 用70%乙醇定容至刻度, 搖勻, 即得。 在412 nm 處測定吸光度, 以吸光度(A)與蘆丁對照品質(zhì)量濃度(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 蘆丁的回歸方程為A=0.03C+0.0065(r=0.9988), 表明蘆丁含量在2.55 ～25.5 μg/mL范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖2 蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin reference

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液1 mL, 置10 mL 容量瓶中, 按“2.4”項(xiàng)下顯色及測定方法, 連續(xù)測定6 次吸光度, RSD 值為2.3%,結(jié)果表明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在室溫條件下, 精密量取試品溶液1 mL, 置10 mL 容量瓶中, 按“2.4” 項(xiàng)下顯色及測定方法, 分別在靜置0, 15, 30,60, 90, 120 min 之后測定吸光度, 計(jì)算RSD 值為1.5%, 表明其在顯色后的120 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次杠板歸藥材約1 g, 共6 份, 精密稱定。 按照“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 按“2.4” 項(xiàng)下方法測定吸光度, 計(jì)算杠板歸總黃酮的平均含量為2.06%, RSD 值為1.6%, 表明該方法重復(fù)性好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

取已知總黃酮含量的杠板歸藥材約0.5 g, 共6 份, 精密稱定。 分別精密加入等量蘆丁對照品, 按“2.1” 項(xiàng)下方法提取杠板歸藥材中的總黃酮, 按“2.4” 項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色并測定吸光度。 結(jié)果顯示平均加樣回收率為101.7%, RSD 為2.3%,表明該方法回收率良好。 見表1。

表1 杠板歸總黃酮加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The experimental results of the total flavonoid recovery rate

2.6 不同產(chǎn)地杠板歸藥材的含量測定

取10 批不同產(chǎn)地的杠板歸藥材粉末, 約1 g, 精密稱定,按“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法, 按“2.4” 項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色, 分別對不同產(chǎn)地杠板歸藥材中總黃酮的含量進(jìn)行測定, 其總黃酮含量在0.59% ～2.19%, 結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地杠板歸總黃酮的含量測定Table 2 Determination of the total flavonoids from different production areas of Polygonum perfoliatum

3 結(jié) 論

本研究采用單因素變量法, 考察了不同的供試液提取方法條件, 以優(yōu)化提取條件, 分別考察不同甲醇與乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%甲醇、 70%甲醇、 甲醇、 50%乙醇、 70%乙醇、 乙醇);不同提取時(shí)間(20, 40, 60, 80, 100, 120 min); 不同提液體積(10, 25, 50, 70 mL)對杠板歸總黃酮提取效率的影響。 結(jié)果表明: 杠板歸藥材約1 g, 用70%乙醇, 提取液體積25 mL,超聲提取時(shí)間80 min, 提取率最高, 且含量穩(wěn)定, 最終選取此方法提取。

杠板歸藥材療效肯定, 已有多種以杠板歸為原料的制劑上市。 杠板歸在我國西南地區(qū)為常用藥物之一, 其野生非常資源豐富, 但常常被當(dāng)做雜草而除掉。 黃酮類成分為杠板歸的主要化學(xué)成分, 也是其重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ), 本實(shí)驗(yàn)研究測定了10 批不同產(chǎn)地的杠板歸藥材總黃酮的含量, 其含量范圍在0.59% ～2.19%之間, 總黃酮差別較大。 10 批藥材分別從玉林、 百色、岑溪、 巴馬、 衡陽、 益陽、 彬州、 吉首、 青島、 海口10 個(gè)不同城市購買或采摘, 總黃酮含量可能與產(chǎn)地有關(guān), 也可能與采收季節(jié)、 采收時(shí)間、 保存方式等原因有關(guān), 其影響因素有待進(jìn)行深入研究。