HPLC 法測定小兒氨酚黃那敏顆粒的溶出度

李春陽, 朱銀宏, 馮雪萍, 程 倩, 張海波

小兒氨酚黃那敏顆粒是一種復方制劑, 其處方為對乙酰氨基酚125 g、 馬來酸氯苯那敏0.5 g、 人工牛黃5 g 及適量輔料,臨床上常用于治療兒童普通感冒和流行性感冒, 因療效顯著,市場占有率較大[1-2]。 現行標準與意見稿中僅規定用紫外分光光度法控制對乙酰氨基酚的含量, 專屬性不強, 且未對其溶出度進行控制, 溶出度是評價藥物質量的重要指標之一, 在一定程度上可預測藥物在體內的溶出和吸收行為[3-6]。 目前對于小兒氨酚黃那敏顆粒的報道多集中在含量測定方面[7-10], 未對其體外溶出行為研究控制。 本文采用高效液相色譜法建立其主要成分對乙酰氨基酚溶出度的測定方法, 并進行了方法學驗證,對不同廠家樣品的溶出度進行測定, 為該產品的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

1260 型高效液相色譜儀, 美國安捷倫公司; XSR205 型分析天平, 瑞士梅特勒-托利多公司; RC806D 型溶出度測定儀,天津市天大天發科技有限公司。

1.2 試 藥

對乙酰氨基酚對照品(批號10008 - 201610, 含量為99.9%), 中國食品藥品檢定研究院; 乙腈(色譜級); 水為純化水; 其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件與系統適用性

采用Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱;流動相: A(0.2% 磷酸水)-B(乙腈)(梯度洗脫0 ～10 min,10%B; 10.5 ～15 min, 35%B; 15.5 ～22 min, 10%B); 流速:1.0 mL·min-1; 檢測波長: 244 nm; 柱溫: 30 ℃; 進樣量:10 μL。 在該色譜條件下進樣分析, 結果對乙酰氨基酚與樣品中其他成分分離度良好, 理論板數按對乙酰氨基酚色譜峰計算不低于10000。

2.1.2 對照品溶液制備

取對乙酰氨基酚對照品25 mg, 精密稱定, 置100 mL 量瓶中, 加稀釋劑適量(以溶出介質為稀釋劑), 溶解后用稀釋劑定容至刻度, 搖勻; 精密移取上述溶液2 mL, 置50 mL 量瓶中,用稀釋劑定容至刻度, 搖勻, 即得。

2.1.3 供試品溶液制備

取本品, 按《中國藥典》2020 年版通則0931 第二法, 以稀鹽酸24 mL 加水至1000 mL 為溶出介質, 轉速為50 r·min-1,溫度為37 ℃, 依法操作, 30 min 時取溶液適量, 濾過, 精密量取續濾液2 mL, 置25 mL 量瓶中, 加稀釋劑稀釋至刻度, 搖勻。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備

稱取按處方配制的輔料和其他成分適量, 用稀釋劑制成不含對乙酰氨基酚的空白溶液, 按2.1 項下方法進樣測定, 結果顯示在對乙酰氨基酚色譜峰位置上未出現色譜峰, 說明其他成分不干擾對乙酰氨基酚的溶出度測定。 對照品溶液、 樣品溶液、 陰性樣品溶液高效液相色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.5 線性關系考察

精密稱取乙酰氨基酚對照品適量, 用稀釋劑制成濃度為101.10 μg·mL-1的對照品儲備溶液。 精密量取上述溶液1、1.5、 2、 2.5、 3 mL, 分別置25 mL 量瓶中, 加稀釋劑稀釋至刻度, 搖勻。 精密吸取10 μL, 按2.1 項下色譜條件進行測定,以對乙酰氨基酚質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標, 峰面積積分值為縱坐標計算回歸方程, 得對乙酰氨基酚的回歸方程為Y=78.635X-0.2698(r = 0.9999) 線性關系良好, 線性范圍為4.04 ～12.13 μg·mL-1。

2.1.6 精密度試驗

精密吸取濃度為10.08μg·mL-1的對乙酰氨基酚溶液, 按2.1 項下色譜條件重復進樣5 次, 記錄對乙酰氨基酚峰面積,RSD 為0.10%, 符合精密度要求。

2.1.7 穩定性試驗

取供試品溶液依法在放置0、 2、 4、 6、 8、 12 h 后按2.1項下色譜條件進樣測定, 結果RSD 為0.27%, 說明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.1.8 重復性試驗

制備6 份供試品溶液, 按2.1 項下色譜條件下分別進樣測定, 計算平均溶出度分別為100.65%、 100.98%、 100.87%、99.64%、 100.10%、 101.37%, RSD 為0.63%, 說明該方法重復性良好。

2.1.9 回收率試驗

按處方量制備除對乙酰氨基酚外的陰性樣品, 按100%濃度分別加入對乙酰氨基酚對照品, 平行制備6 份, 按供試品溶液制備方法制備, 按照上述色譜條件, 分別精密吸取10 μL 進樣測定, 記錄色譜圖, 計算平均加樣回收率, 結果見表1。

表1 溶出度的回收率測定結果(n=6)Table 1 The results of recovery for dissolution(n=6)

2.2 溶出度測定

2.2.1 轉法的選擇

籃法和槳法是目前最常用的溶出度測定方法。 目前市售的小兒氨酚黃那敏顆粒有1、 2、 3、 6 g 等包裝規格, 另外本品處方中含有部分中藥成分, 在溶出度的測定過程中有黏附轉籃篩網的風險, 根據上述因素, 綜合考慮最終選擇槳法。

2.2.2 轉速與取樣時間的選擇

溶出轉速的篩選批次為19102801 的小兒氨酚那敏顆粒, 按照《中國藥典》2020 版四部溶出度與釋放度測定法第二法, 以稀鹽酸24 mL 加水至1000 mL 為溶出介質, 分別比較50、 75 r·min-1兩種轉速, 依法操作, 分別于20、 30、 45、 60 min 時精密量取溶液10 mL 濾過, 精密量取濾液2 mL, 置25 mL 量瓶中, 加稀釋劑稀釋至刻度, 搖勻。 按2.1 項下色譜方法測定溶出度, 結果表明, 取樣時間為30 min 時, 兩種轉速的溶出度均達到90%以上。 50 r·min-1比75 r·min-1的實驗條件更溫和, 區分力更強, 更趨近人體胃腸蠕動的實際情況, 因此最終選擇轉速為50 r·min-1, 取樣時間為30 min。

2.2.3 溶出介質選擇

考察4 種溶出介質測定溶出度, 分別為鹽酸溶液(24 mL 稀鹽酸溶液用水稀釋至1000 mL)、 水、 pH 4.5 的磷酸鹽緩沖液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液, 按照《中國藥典》2020 版四部溶出度與釋放度測定法第二法, 溶出介質體積1000 mL, 轉速50 r·min-1, 溫度37 ℃, 取樣時間30 min, 依法操作, 按2.1 項下色譜方法測定溶出度。 結果表明對乙酰氨基在不同介質中溶出度無明顯差異, 同時參照《中國藥典》收載收載對乙酰氨基酚片劑、 膠囊劑、 顆粒劑的溶出度測定, 最終選擇鹽酸溶液(24 mL 稀鹽酸溶液用水稀釋至1000 mL)為溶出介質。

2.2.4 樣品測定

取4 批不同廠家樣品, 每批6 袋, 照2.2 項下溶出度測定方法操作, 按照2.1 項下色譜條件進樣測定, 計算每包樣品的溶出度及每批樣品的平均溶出度。 結果表明樣品在30 min 時溶出度均已超過標示量的95%, 見表2。

表2 不同批次的樣品中對乙酰氨基酚溶出度測定結果Table 2 The dissolution results of paracetamol in different batches of drugs

3 討 論

3.1 波長選擇

取對乙酰氨基酚對照品適量, 精密稱定, 以溶出介質為稀釋劑, 制成濃度為10 μg·mL-1的溶液, 對其進行全波長掃描,發現對乙酰氨基酚在244 nm 波長處有最大吸收, 與文獻相同[11-13], 選擇檢測波長為244 nm。

3.2 流動相選擇

考察了0.05 moL·L-1磷酸二氫鉀緩沖液-甲醇、 水-甲醇、 水-乙腈、 0.2%磷酸水-乙腈(梯度洗脫)等色譜條件條件,結果以0.2%磷酸水-乙腈為流動相(梯度洗脫)條件下色譜峰分離度較好, 進一步比較0.2%磷酸水-乙腈不同梯度洗脫條件, 結果以正文中流動相條件對目標峰的出峰時間、 峰形、 分離度等均達到最佳狀態。

3.3 耐用性試驗

分別在改變流動相比例、 柱溫、 流速或使用不同型號色譜柱的條件下進樣測定, 結果顯示對乙酰氨基在各條件下含量RSD 值均小于2%, 表明該檢測方法耐用性強。

3.4 結 論

本文建立了小兒氨酚黃那敏顆粒中對乙酰氨基酚溶出度的測定方法, 并通過了相關方法學驗證, 表明該方法簡便易行、準確可靠, 為小兒氨酚黃那敏顆粒溶出度方法的建立及質量標準的提升提供了一定的試驗依據。