TRIP13在非小細胞肺腺癌中促增殖侵襲和血管生成的影響及作用機制

董 巖， 李佳蔚， 賈依娜爾， 黃詠梅， 張 嶠

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院， 新疆 烏魯木齊 830000)

根據2020年世界衛生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)發布的全球癌癥數據顯示，肺癌是威脅全球人類生命健康的第二大癌癥[1]。非小細胞肺癌 (NSCLC)是肺癌的一種，約占所有肺癌病例的85%，其發病率在世界范圍內逐年增加[2]。NSCLC包括多種癌癥類型，最常見的是肺腺癌 (Lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鱗癌 (Lung squamous cell carcinoma，LUSC)[3]。目前的輔助化療提高了NSCLC患者的生存率，但是它也存在致殘或致死的風險[4]。甲狀腺激素受體作用因子13(Thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13)在調節有絲分裂過程中起關鍵作用，包括紡錘體組裝檢查和DNA修復，這可能是染色體不穩定從而產生癌癥的原因[5]。因此TRIP13可能是人類癌癥的新治療靶點。近年來，越來越多的研究發現，TRIP13在多種癌癥中過度表達，與癌癥的發展密切相關，影響患者的生存率。Agarwal等[6]發現TRIP13能促進結直腸癌腫瘤生長和轉移，TRIP13可能是結直腸癌的治療靶點。Zhou等[7]的研究證明，TRIP13通過調節Notch信號通路促進上皮性卵巢癌發展，而沉默TRIP13可抑制細胞增殖，減少細胞侵襲和遷移，并在體外誘導上皮性卵巢癌細胞凋亡。此外TRIP13能夠調節NSCLC細胞增殖、侵襲和細胞周期檢查點，可能是臨床上診斷和治療肺癌的有用標志物[8]。但是目前TRIP13與NSCLC之間的相互關系仍需進一步研究，在本實驗中，我們收集了肺腺癌與鱗腺癌的患者的腫瘤組織與癌旁組織，并使用兩種腫瘤細胞系，評估了TRIP13的表達，并探索了TRIP13可能的致癌機制，為將來研究NSCLC的致病機制和治療提供參考價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：從2018年2月至2020年2月在我院接受切除手術的NSCLC患者中收集了45例腫瘤及其癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5mm)。手術取材后將樣本立即放在凍存管并置于液氮中，隨后在-80℃冰箱保存。所有患者手術前未接受放化治療，患者均簽署知情同意書，本研究在我院倫理委員會的監督下獲得批準和實施。人肺腺癌細胞系A549和肺鱗癌細胞系SKMES1均購自中國科學院上海研究所細胞庫，RPMI1640培養基、多聚甲醛和結晶紫溶液均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，TRIzol、逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑購自上海翌圣公司，Transwel購自康寧公司，CCK8試劑購自上海信裕公司，TRIP13抗體、GAPDH抗體購自abcam公司，TRIP13、VEGFA和GAPDH 的qPCR引物由上海生工生物公司合成；過表達TRIP13的慢病毒(PLK-TRIP13)及陰性對照病毒(PLK-NC)由上海漢恒生物科技有限公司構建。

1.2細胞培養：人肺腺癌細胞系A549和肺鱗癌細胞系SKMES1均使用含10%FBS的RPMI 1640培養基，將所有細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中，根據細胞生長密度更換新鮮培養基。當細胞生長融合度達到80%～90%時進行消化傳代，選擇對數生長期細胞進行下一步實驗。

1.3慢病毒轉染實驗：分別設置為A549組(轉染PLK-NC)與A549+PLK-TRIP13組(轉染PLK-TRIP13)、SKMES1組(轉染PLK-NC)與SKMES1+PLK-TRIP13(轉染PLK-TRIP13)。細胞在含10% FBS的培養基中培養，當細胞生長密度達到70%～80%時轉染病毒。轉染前1d，細胞用0.25%胰蛋白酶消化后接種于24孔板(1×105個細胞/孔)。用陰性對照病毒測定兩個細胞的轉染條件和感染復數值，根據MOI值計算每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細胞數)/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/mL]。每孔加入2.5μL聚凝胺(2mg/mL)，然后加入培養基補充體積至500μL/孔。48h后，更換新鮮培養基繼續培養。72h 后收集細胞并檢測TRIP13過表達的效果。

1.4細胞侵襲實驗：A549 細胞和 SKMES1 細胞分別接種在6孔板中，每孔2×104個細胞，加入100μL無血清RPMI 1640培養基懸浮細胞，將6000μL含20%血清的RPMI 1640培養基加入小室，在培養箱中培養48h。移走小室并傾倒培養基，然后在含有多聚甲醛和結晶紫的溶液中連續固定和染色。用棉簽擦拭室內的未侵襲的細胞，并在顯微鏡下拍照。對每個視野中的侵襲細胞進行計數。

1.5CCK8細胞增殖實驗：取對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化并離心。用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基將細胞稀釋成單細胞懸液，接種到96孔板中。細胞濃度調至8000個/孔，置37℃、5%CO2培養箱。在24h、48h和72h時，每孔加入20 μL CCK8溶液，2h后用酶標儀測定450nm處的吸光度(A)值。

1.6qRT-PCR法：TRIzol試劑提取NSCLC及癌旁組織樣本、A549和 SKMES1 細胞中的總RNA，酶標儀檢測總RNA的純度和含量。按照qRT-PCR試劑盒實驗說明，依次進行逆轉錄和qRT-PCR實驗。qRT-PCR反體系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O補充至10μL。qRT-PCR反應條件：95oC(30s)預變性后，變性95oC(7s)，退火55℃(30s)，72℃(15s)，40個循環周期。擴增結果根據2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列：CAPDH-F，5-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3，CAPDH-R，5-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3；TRIP13-F，5- TGCATGCACTGTTGCACTTC-3，TRIP13-R，5- GGGTTGCACAAGTATCACGC-3；VEGFA-F，5- GTCCTGGAGCGTGTACGTTG -3,VEGFA-R，5- CTTCCGGGCTCGGTGATTTA-3。

1.7Western blot法：收集各組細胞，RIPA裂解提取總蛋白，BCA法定量蛋白。變性后用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白質，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶4℃密封1h，TBST洗膜5min，3次。加入TRIP13-b抗體(1∶2000)，4℃搖床過夜。TBST膜洗滌5min，3次。加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶1000)，37℃孵育1h。TBST膜洗滌5min，5次。蛋白質條帶灰度值通過image-Pro Plus Image分析系統進行分析。 實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1NSCLC 中TRIP13表達量改變與臨床病理特征間的關系：通過qRT-PCR分析NSCLC腫瘤和配對的癌旁組織中TRIP13表達水平。結果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC患者腫瘤組織中TRIP13的表達水平顯著升高(1.00±0.34 vs 7.69±2.14,P=0.007)，見圖1。

圖1 NSCLC腫瘤及癌旁組織中TRIP13表達差異注：與癌旁組織比較，**P<0.01

根據TRIP13相對表達水平(腫瘤組織/癌旁組織)的中位數5.62，將45例患者分為TRIP13低表達組(腫瘤組織/癌旁組織<5.62，n=22)和高表達組(癌旁組織/癌組織≥5.62，n=23),并分析患者TRIP13表達量與臨床病理特征間的關系。結果顯示，大部分肺腺癌患者相對高表達TRIP13(P<0.05)，而大部分肺鱗癌患者低表達TRIP13(P<0.05)。此外TRIP13的表達水平與NSCLC患者淋巴結轉移、腫瘤進展程度相關(P<0.05)，與性別、年齡因素無關(P>0.05)。提示TRIP13可能在肺腺癌中發揮關鍵作用，影響腫瘤的惡化和轉移，見表1。通過Kaplanmeier-plotter數據庫進一步分析TRIP13與肺腺癌和肺鱗癌患者相關性，發現TRIP13的表達水平能夠影響肺腺癌的預后，而對肺鱗癌的預后沒有影響，見圖2。

圖2 Kaplanmeier-plotter數據庫分析TRIP13表達水平與肺癌患者預后的關系

表1 TRIP13表達差異與臨床病理特征相關性比較

2.2過表達TRIP13的NSCLC細胞系構建：通過慢病毒將PLK-NC和PLK-TRIP13分別轉染至非小細胞肺腺癌A549和非小細胞肺鱗癌SKMES1細胞。采用qRT-PCR和western blot檢測各組細胞TRIP13 mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，A549組細胞的TRIP13 mRNA和蛋白表達水平均高于SKMES1組(1.00±0.24 vs 0.26±0.03,P=0.001；1.00±0.22 vs 0.21±0.05,P=0.006)。與A549組相比，A549+PLK-TRIP13組細胞TRIP13 mRNA和蛋白表達水平提高(1.00±0.24 vs 5.65±0.63,P=0.001；1.00±0.22 vs 1.72±0.21,P=0.004)。與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細胞TRIP13 mRNA和蛋白表達水平提高(0.26±0.03 vs 0.826±0.07,P=0.003；0.21±0.05 vs 0.86±0.03,P=0.001)，見圖3。說明過表達TRIP13的NSCLC穩轉細胞系構建成功。

圖3 過表達TRIP13的NSCLC細胞系鑒定注：與A549組比較，**P<0.01，***P<0.001；與SKMES1組比較，**P<0.01

2.3過表達TRIP13對A549細胞增殖和侵襲的影響：CCK8結果顯示，與A549組相比，A549+PLK-TRIP13組細胞增殖能力提高，在72h時表現出顯著性差異(1.12±0.27 vs 1.73±0.20,P=0.004)，見圖4A。Transwell結果顯示，與A549組相比，A549+PLK-TRIP13組細胞侵襲數量增加(214.25±11.64 vs 384.69±23.54,P=0.001)，見圖4B。

圖4 過表達TRIP13對A549細胞增殖和侵襲的影響注：與A549組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.4過表達TRIP13對A549細胞血管生成的影響：采用western blot檢測A549細胞血管生成相關蛋白VEGF的表達水平。結果顯示，與A549組相比，A549+ PLK-TRIP13組細胞VEGF蛋白表達水平提高(0.51±0.16 vs 0.97±0.15,P=0.006)，見圖5。

圖5 過表達TRIP13對A549細胞血管生成的影響注：與A549組比較，**P<0.01

2.5過表達TRIP13對SKMES1細胞增殖、侵襲和血管生成的影響：我們探究TRIP13在非小細胞肺鱗癌SKMES1細胞中的作用。CCK8實驗結果顯示，與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細胞增殖能力沒有顯著差異(1.52±0.13 vs 1.59±0.14,P=0.482)，見圖6A。Western blot實驗結果顯示，與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細胞VEGF蛋白表達水平略微升高，但無顯著性差異(0.78±0.09 vs 0.82±0.15,P=0.672)，見圖6B。Transwell實驗結果顯示，與SKMES1組相比，SKMES1+PLK-TRIP13組細胞侵襲數量增加，有顯著性差異(159.85±14.57 vs 174.39±9.50,P=0.032)，見圖6C。結果表明過表達TRIP13對非小細胞肺鱗癌的影響較少，僅能輕微促進細胞侵襲和血管生成。

圖6 過表達TRIP13對SKMES1細胞增殖、侵襲和血管生成的影響注：與SKMES1組比較，*P<0.05

3 討 論

肺癌是全球致死率最高的惡性腫瘤，每年有眾多患者死于肺癌。到目前為止，針對特定腫瘤中某些分子改變的靶向治療方法已成功用于肺腺癌，需要更多的研究闡述癌細胞內的分子相互作用，從而實現創新藥物設計，指導精確的癌癥治療。

TRIP13是ATPases家族的一個保守的成員，是特定染色體事件的關鍵調節因子，在減數分裂程序中，它參與控制G2的前期過程，如DNA斷裂重組、檢查點信號傳導等[5]。很多研究表明TRIP13與癌癥的發生發展密切相關，該基因定位于細胞膜和細胞質，并在體外和體內均能表現出致癌作用。本實驗研究發現，與癌旁組織相比，非小細胞肺腺癌患者腫瘤組織中TRIP13的表達水平顯著升高，TRIP13的表達水平能夠影響肺腺癌的預后，然而在肺鱗癌患者中，TRIP13的表達水平沒有變化，TRIP13對于肺鱗癌患者的預后沒有影響，表明的TRIP13可能僅與肺腺癌發展相關，而與肺鱗癌的發病無相關性。

研究證明，TRIP13可以通過控制腫瘤細胞的增殖和遷移來促進癌癥發展。例如，TRIP13干擾通過調節TTC5/p53通路和上皮間質轉化相關基因表達抑制甲狀腺癌細胞的增殖和轉移[9]，在結直腸癌向肝臟轉移的過程中，肝臟與結直腸中均顯示TRIP13過表達，TRIP13敲低會阻礙結直腸癌細胞的集落形成、侵襲、運動和球體形成能力[10]。另外也有研究證實，TRIP13表達與肺癌患者的腫瘤大小和患者的高死亡率呈正相關，TRIP13促進肺腺癌細胞增殖、克隆形成和遷移，同時在體外抑制肺腺癌細胞的凋亡[11]。在本實驗研究發現過表達TRIP13的A549肺腺癌細胞侵襲數量顯著增加。VEGF是一種參與機體所有血管生成的細胞因子，對內皮細胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，高表達則可以促進血管的通透性和細胞遷移能力[12]，過表達TRIP13的A549肺腺癌細胞的VEGF蛋白表達顯著提高，說明過表達TRIP13可能通過促進肺腺癌細胞增殖和侵襲和血管生成參與疾病的發展，但是過表達TRIP13對SKMES1肺鱗癌細胞的影響較少，僅能輕微促進細胞侵襲和血管生成。以上說明TRIP13對非小細胞肺腺癌影響較大，對鱗癌影響較少。

另外，本實驗也存在一些不足之處，本實驗中僅采取了兩種NSCLC細胞來驗證TRIP13與肺腺癌與肺鱗癌可能存在的相互關系，因此無法認為所有的肺腺癌患者均與TRIP13基因相關而肺鱗癌患者與TRIP13基因無關，后續需要使用多種NSCLC細胞系進行進一步驗證。

綜上所述，TRIP13在非小細胞肺腺癌組織和細胞中呈現高表達，TRIP13增加了非小細胞肺腺癌細胞的增殖侵襲和促血管生成作用。以上結果初步明確了，TRIP13在非小細胞肺腺癌發生發展中的作用，可為進一步探討非小細胞肺腺癌的增殖和轉移機制提供新的思路。