血清miR-647 PTEN與ACS患者PCI術后支架內再狹窄的關系

徐 晶, 白 凈

(陜西省人民醫院心血管內科, 陜西 西安 710068)

經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)常用血管重建方法之一，能快速疏通狹窄或閉塞冠狀動脈管腔，改善心肌血流灌注。但PCI后即使規范用藥仍有較高幾率出現支架內再狹窄，嚴重影響患者預后。新生動脈粥樣硬化(neo atherosclerosis，NAS)是第二代藥物洗脫支架后支架內再狹窄和支架晚期治療失敗最重要病理機制，與血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMS)增殖、遷移密切相關[1,2]。微小RNA(microRNAs，miRNA)參與多種細胞因子轉錄調控，能通過調控VSMS增殖、遷移促進動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發生發展[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種多功能蛋白，研究報道其能抑制VSMS增殖、遷移，參與AS病理發展過程[4]。本研究旨在分析ACS患者血清miR-647，PTEN水平變化，探討二者與PCI后支架內再狹窄的關系，以前為臨床早期防治提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對象:選取2019年1月至2020年5月我院收治的209例接受PCI的ACS患者。納入標準：①符合《急性冠脈綜合征急診快速診治指南》[5]ACS診斷標準；②首次確診，發病至就診時間<24h；③具備PCI指征；④年齡18～<80歲；⑤臨床資料完整者。排除標準：①既往血管旁路手術治療或PCI史；②近期接受外科手術治療者；③不能接受隨訪者；④合并惡性腫瘤者；⑤肝、腎等重要臟器功能損害者；⑥先天性心臟病者；⑦合并免疫、血液系統疾病者；⑧合并急慢性感染者。本研究經倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑:PCR擴增儀購自賽默飛世爾科技公司；Trizol試劑盒購自北京柏萊斯特科技發展有限公司；Takara和qPCR試劑盒購自寶日醫生物技術有限公司；PTEN試劑盒：北京百奧萊博科技有限公司。

1.3方 法

1.3.1基礎資料收集:收集患者基礎資料，包括性別、年齡、體質指數、吸煙史、飲酒史、病史、病變支數、支架數量、支架內徑、支架長度、Killip分級(分為Ⅰ～Ⅳ級)、Gensini積分(總分為冠脈狹窄程度計分×病變部位計分)和PCI術后次日空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.3.2血清miR-647，PTEN水平檢測:采集患者PCI術后次日清晨空腹靜脈血，3000rpm/min離心20min (半徑8cm)，取上清存于-80℃冰箱中至檢測。部分血清使用Trizol試劑盒提取總RNA，Takara逆轉錄試劑盒合成cDNA，進行qPCR擴增。miR-647上游引物：5'-GTGTTGGCCTGTGGCTG-3'，下游引物：5'-CTGACCCTCCCTCCTGC-3'；內參U6上游引物：5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。20μL反應體系：2μL cDNA模板、1μL引物、10μL qPCR Master Mix、6μL RNase-Free ddH2O；反應條件：95℃ 10min (1個循環)，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s (40個循環)。目標基因血清相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。部分血清使用ELISA檢測PTEN水平，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3支架內再狹窄判定:支架內再狹窄定義為冠狀動脈造影證實支架兩端和/或全程5mm節段內管腔丟失，管腔狹窄程度≥50%[6]。所有患者PCI后均隨訪1年，根據是否發生支架內再狹窄分為再狹窄組和無再狹窄組。

2 結 果

2.1兩組患者基礎資料比較:隨訪1年，209例ACS患者PCI術后1年共出現45例支架內再狹窄，發生率為21.53%(45/209)。再狹窄組支架內徑小于無再狹窄組，支架長度長于無再狹窄組，HDL-C水平低于無再狹窄組，Gensini積分高于無再狹窄組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者基礎資料比較±s，n(%)]

2.2兩組患者血清miR-647，PTEN水平比較及相關性:與無再狹窄組比較，再狹窄組血清miR-647顯著降低，有統計學差異(1.02±0.25 vs.0.79±0.20，t=6.635，P<0.001)；PTEN顯著升高，有統計學差異(2.38±0.85 vs.3.52±1.13，t=-6.291，P<0.001)。ACS患者血清miR-647與PTEN水平呈負相關(r=-0.701，P<0.001)。見圖1。

圖1 血清miR-647與PTEN水平的線性散點圖

2.3ACS患者PCI術后支架內再狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析:以支架內徑、支架長度、HDL-C，Gensini積分、miR-647，PTEN為自變量，PCI術后支架內再狹窄(是=1，否=0)為因變量，支架內徑、PTEN為PCI術后支架內再狹窄獨立保護因素，Gensini積分、miR-647為獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 ACS患者PCI術后支架內再狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4血清miR-647，PTEN水平對ACS患者PCI術后支架內再狹窄的預測價值:miR-647+PTEN預測ACS患者PCI術后支架內再狹窄的AUC大于各指標單獨預測(Z=2.971、2.521，P=0.003、0.012)。見表3、圖2。

圖2 血清miR-647，PTEN水平預測ACS患者PCI術后支架內再狹窄的ROC曲線

表3 血清miR-647 PTEN水平對ACS患者PCI術后支架內再狹窄的預測價值

3 討 論

目前隨著全國各地的ACS區域協同救治體系的逐漸完善，極大的降低了ACS死亡率，但PCI后支架內再狹窄仍然是一個難題。NAS指支架術后新生內膜組織中迅速聚集富含泡沫的巨噬細胞，伴或不伴鈣化和/或壞死核心，VSMS是血管壁中層最豐富的細胞類型，在某些應激條件下分化、增殖、遷移能促進壞死脂質核心和纖維帽形成，在AS發生發展及血栓形成中發揮重要作用[7]。

miRNA是一組非編碼小分子RNA，能抑制靶miRNA翻譯在轉錄后水平調控基因的表達，近年研究表明，miRNA能通過調控炎癥反應、VSMS、血管內皮細胞等途徑參與PCI術后支架內再狹窄發生[8]。miR-647位于染色體20q13.33，已被認為一系列癌癥的腫瘤抑制因子。長鏈非編碼RNA- APPAT(LncRNA APPAT)與AS形成和冠狀動脈嚴重狹窄有關，近年研究發現心肌梗死后VSMS和循環中miR-647表達均上調，且與LncRNA APPAT表達呈負相關，提示miR-647可能參與AS發展[3]。本研究結果顯示，再狹窄組血清miR-647表達升高，是導致PCI術后支架內再狹窄的獨立危險因素，分析與miR-647能促進VSMS增殖、遷移參與NAS形成有關。Xu等[9]使用氧化型低密度蛋白處理人主動脈VSMC建立體外AS模型發現，miR-647表達上調，敲低miR-647能抑制VSMC增殖、遷移。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路廣泛調控細胞增殖、黏附、分化、遷移、凋亡等功能，該信號通路異常活化往往與細胞惡性轉化有關，也能通過促進VSMS增殖、遷移參與AS進展[10]。PTEN不僅是一種多功能蛋白，還是分化的VSMS表型的一個重要調節劑，研究發現VSMS脫落正常生長抑制機制后，其內PTEN活性喪失，敲除小鼠動脈中膜和內膜中PTEN后能加速AS進展[11]。研究表明，PTEN的去磷酸化作用能使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路去磷酸化，進而抑制該通路的活性，通過上述途徑抑制AS進展[12]。本研究結果顯示，再狹窄組血清PTEN水平降低，是PCI術后支架內再狹窄的獨立保護因素，說明PTEN參與PCI術后支架內再狹窄發生，考慮與PTEN能抑制VSMS增殖、遷移抑制NAS形成有關。本研究顯示，ACS患者血清miR-647與PTEN水平呈負相關，說明二者可能共同參與支架內再狹窄發生。研究發現，PTEN為miR-647的直接靶點，AS模型中PTEN能靶向抑制PTEN上調磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路活性，促進VSMS增殖、遷移。ROC曲線結果表明，血清miR-647，PTEN水平均可作為ACS患者PCI術后支架內再狹窄的預測指標，聯合檢測血能提高支架內再狹窄的預測能效。

綜上所述，PCI術后支架內再狹窄ACS患者血清miR-647水平升高，PTEN水平降低，二者可能共同參與支架內再狹窄，可作為支架內再狹窄預測指標。但研究僅限于觀察血清水平變化，未進一步分析二者參與支架內再狹窄中的機制。