聚多巴胺對H2O2誘導的骨關節炎軟骨細胞氧化損傷和炎癥反應的作用研究*

陳穎，李康路，鄭立△

（1.廣西醫科大學生命科學研究院，南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021；3.廣西生物醫藥協同創新中心 廣西—東盟重大疾病預防協同創新中心，南寧 530021）

骨關節炎（OA）是一種漸進性、致殘性疾病，影響患者的關節軟骨及滑膜關節。軟骨細胞、滑膜及細胞外基質（ECM）中的異常關節組織會導致軟骨退化、滑膜炎癥以及骨贅和軟骨下囊腫的形成[1]。研究表明，活性氧（ROS）是OA發展過程中的重要因素。據報道，正常關節中維持低水平的ROS，而在OA患者的關節中ROS的過度產生引起過氧化、蛋白質羰基化和DNA損傷，被認為是軟骨細胞丟失和組織損傷的主要機制[2]。聚多巴胺（PDA）是一種由多巴胺（DA）自聚合產生的多功能納米顆粒（NP），具有清除ROS的能力，具有豐富的還原基團，如兒茶酚和醌[3-4]。然而，目前很少有研究評估PDA在OA治療中的應用，此外，PDA能否調控細胞內ROS的產生及其特異性調控機制尚不清楚。本研究旨在探討PDA在炎癥環境下通過清除ROS促進OA修復的作用，以期為OA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性SD乳鼠，3～7日齡，體重10～15 g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（桂）2020-0003，動物使用許可證號：SYXK（桂）2020-0004。本研究所有動物實驗及處置均已取得廣西醫科大學實驗動物倫理委員會的批準，審批號：202112004。

1.2主要試劑 鹽酸多巴胺（Aladdin，中國）；無水乙醇、氨水（國藥集團化學試劑有限公司，中國）；總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（Solarbio，中國）；75%酒精（廣西博恒醫療用品有限公司）；胎牛血清、高糖培養基（Gibco，美國）；鈣黃綠素（Calcein-AM）、30%過氧化氫（H2O2）（成都金山化學試劑有限公司）；CCK-8試劑盒（賽國生物科技有限責任公司，中國）；ROS檢測試劑盒（Beyotime，中國）；白細胞介素-6（IL-6）抗體、FITC標記山羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，美國）；山羊血清（北京中杉金橋生物技術有限公司）；總RNA提取試劑盒（Magon，美國）；基質金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、一氧化氮合成酶（iNOS）、Ⅱ型膠原纖維α1（COL2A1）PCR引物（金開瑞，中國）。

1.3 PDA的制備[5]在130 mL去離子水和無水乙醇的混合溶液（40 mL無水乙醇+90 mL去離子水）中加入3 mL氨水，調節pH至8.5，攪拌30 min，加入含0.5 g鹽酸多巴胺的去離子水10 mL，攪拌后靜置24 h；10 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用超純水洗滌3～4次，最后將PDA放入冷凍干燥機中干燥24 h，備用。

1.4 PDA的表征 取部分干燥后的PDA進行SEM、XRD和FTIR表征，另外取少量PDA通過超聲使其均勻分散于超純水中，用于TEM檢測。

1.5 T-AOC的檢測 配置不同濃度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL）的PDA溶液。按照T-AOC試劑盒說明書步驟檢測PDA的抗氧化能力。

1.6軟骨細胞原代培養 頸椎脫臼法處死乳鼠，75%酒精浸泡消毒；在無菌條件下取雙側股骨頭和膝關節，置于含2%青—鏈霉素的PBS緩沖液中，去除軟骨周圍肌肉、血管等；將軟骨剪為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm小塊，用0.2%胰蛋白酶消化30～40 min后，用0.02%的Ⅱ型膠原酶消化過夜，1 000 r/min離心5 min，分離出游離的軟骨細胞；置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，每3 d換1次DMEM（高糖）培養基，細胞密度達到80%～90%時進行細胞傳代。使用第3～4代軟骨細胞進行實驗。

1.7 CCK-8法檢測軟骨細胞增殖 將軟骨細胞接種于96孔板中，調整細胞密度為8×103個/孔，培養12 h后，去除培養基，加入100μL不同濃度的PDA（實驗組），并設空白組，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養；去除培養基，PBS緩沖液清洗2次，加入100μL含CCK-8溶液的無血清培養基，繼續培養2 h，用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度（OD）值。計算細胞增殖率，即（OD值實驗組-OD值空白組）/（OD值對照組-OD值空白組）×100%。

1.8鈣黃綠素（Calcein-AM）染色檢測細胞活性

將軟骨細胞分為正常組、模型組和處理組。模型組加入1 mL含H2O2的無血清培養基，誘導氧化應激反應0.5 h。處理組加入PDA處理24 h。PBS緩沖液清洗2次，加入0.03% Calcein-AM、0.15%EthD-I染色試劑，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中避光孵育5 min，PBS緩沖液清洗3～4次去除過量的熒光試劑，熒光正置顯微鏡下觀察細胞情況并拍照。Image J軟件統計活死細胞數目，計算軟骨細胞增殖率。

1.9 DCFH-DA熒光探針檢測軟骨細胞內ROS水平 分組處理細胞后，PBS緩沖液清洗，加入10μmol/L DCFH-DA熒光探針稀釋液（1∶1 000）1 mL，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中避光孵育30 min，用無血清培養基輕輕吹洗去除過量熒光試劑，熒光正置顯微鏡下觀察、拍照。用Image J軟件分析綠色熒光強度。熒光強度越高，表明細胞ROS水平越高。

1.10免疫熒光染色檢測軟骨細胞中IL-6的表達

分組處理細胞后，加入4%多聚甲醛固定10 min，3%H2O2孵育15 min，山羊血清孵育30 min；滴加一抗（IL-6，1∶200）4℃冰箱孵育過夜，PBS緩沖液清洗2次，滴加二抗（1∶200）37℃避光孵育1.5 h，PBS緩沖液清洗2次；用DAPI標記細胞核（藍色），室溫下避光孵育10 min，PBS緩沖液清洗2次。熒光顯微鏡下觀察、拍照。Image J軟件分析綠色熒光強度，即IL-6的表達水平。

1.11 RT-qPCR法檢測炎癥相關基因及軟骨特異性基因的表達 提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀上進行qPCR反應。以GAPDH作為內參，檢測炎癥基因MMP-3、MMP-13和iNOS和軟骨特異性基因COL2A1的表達。引物序列見表1，使用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.12統計學方法 使用GraphPad Prism 8.0軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SEM和TEM表征SEM和TEM的結果表明PDA納米粒子成功合成，且在水溶液中具有良好分散性。PDA呈大小均一的球形，直徑在100～150 nm左右，見圖1。

圖1 PDA電鏡圖

2.2 XRD和FTIR表征XRD對PDA的晶體結構進行表征，在2θ=22.9o處出現窄而強的峰（圖2A），代表PDA的成功合成；FTIR進一步驗證，3 356 cm-1處的波長對應—OH和—NH峰，1 606 cm-1、1 415 cm-1和1 288 cm-1處的波長分別代表C=O、C=C和C—O。在約700 cm-1處的吸收帶PDA明顯弱于DA，表明在PDA中芳香族結構的減少和預期的聚合反應的減少，見圖2B。

圖2 PDA的XRD和FTIR表征

2.3 PDA的抗氧化能力當PDA濃度為20μg/mL時，總抗氧化能力提高，且其總抗氧化水平隨著PDA濃度的增加而升高，見圖3。

圖3 PDA的T-AOC檢測結果

2.4 PDA對軟骨細胞的毒性作用CCK-8結果顯示：當PDA的濃度低于100 μg/mL時，對軟骨細胞無明顯毒性作用，見圖4。因此，選擇100μg/mL的PDA進行下一步實驗。

圖4 CCK8檢測PDA對軟骨細胞的毒性作用

2.5 3組軟骨細胞活性及細胞內ROS水平比較

與正常組比較，模型組軟骨細胞增殖率降低，細胞內ROS水平升高；而經PDA處理后，細胞增殖率升高，細胞內ROS水平降低，見圖5。

圖5 3組軟骨細胞活性及細胞內ROS水平比較

2.6 3組軟骨細胞中IL-6蛋白表達比較 與正常組比較，模型組IL-6蛋白表達升高；而經PDA處理后，IL-6蛋白表達降低，見圖6。

圖6 免疫熒光顯示IL-6的表達情況（×100）

2.7 3組軟骨細胞中MMP-3、MMP-13、COL2A1、iNOS基因表達比較 模型組MMP-3、MMP-13及iNOS的基因表達均高于正常組，而COL2A1表達低于正常組；與模型組比較，處理組MMP-3、MMP-13和iNOS表達下降，而COL2A1表達上升，見圖7。

圖7 炎癥相關基因和軟骨特異性基因的表達

3 討論

PDA來自海洋貽貝，具有獨特的物理和化學性質，包括高光熱轉移效率、良好的藥物結合能力、廣泛的黏附能力以及良好的生物相容性和生物降解性，在生物醫學領域展示出巨大潛力[6]。本研究中，電鏡結果顯示PDA呈均一球形，XRD在22.9o出現特征峰，表明PDA的成功合成[7]；FTIR在3 356 cm-1、1 616 cm-1、1 415 cm-1、1 288 cm-1出現的特征峰進一步得到驗證[8]。

OA中過量ROS的產生會改變細胞內信號轉導，縮短軟骨細胞生命周期，降低軟骨基質代謝，并導致滑膜炎癥和軟骨細胞功能障礙[9]。因此，清除過量ROS可作為治療OA的策略。本研究結果顯示，PDA能夠促進軟骨細胞增殖，降低軟骨細胞內的ROS水平。表明PDA對軟骨細胞具有保護作用。炎癥因子的過表達會造成骨組織及軟骨組織的破壞[10]。降低炎癥因子的過度表達在延緩OA的進程中發揮著重要作用。本研究發現，PDA能夠下調MMP-3、MMP-13、iNOS基因及IL-6蛋白表達，上調軟骨特異性基因COL2A1表達。表明PDA能抑制H2O2誘導的軟骨細胞炎癥反應，促進Ⅱ型膠原的合成。此外，T-AOC檢測結果表明，PDA具有一定的抗氧化能力，這與DCFH-DA熒光探針檢測軟骨細胞內ROS水平的結果相一致，且隨著PDA濃度增加，其抗氧化水平升高。

綜上所述，PDA能夠抑制H2O2誘導的OA軟骨細胞氧化損傷和炎癥反應，促進細胞存活，有望成為治療OA的一種新型生物材料。