朝天罐總酚對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞炎癥反應的調控作用*

張琳珮，陳依雨，陸洪艷，史雯雪，郭 玲，蔣霞

（廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021）

炎癥是人體抵御外源性入侵物或調節機體免疫反應失調必不可少的防御手段[1]。在炎癥反應過程中，巨噬細胞參與機體的免疫反應，在炎癥反應過程中具有重要作用[2]。研究顯示，中草藥可降低脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞中腫瘤壞死因子（TNF）-α、一氧化氮（NO）等炎癥因子水平[3-4]。朝天罐（Osbeckia opipara C.Y.Wu et C.Chen）為野牡丹科金錦香屬植物，是廣西少數民族地區的常用藥材，主要以根入藥，其味甘、微苦，性平，歸腎、大腸經，功能益腎、止血、解毒[5-6]。目前大量研究表明，酚類化合物在抗炎方面有很高的研究價值和應用前景[7-8]。本課題組前期研究發現，朝天罐總酚為朝天罐根中重要的活性物質，朝天罐粗提物具有抗炎作用[9-11]。但目前對LPS刺激下朝天罐總酚的抗炎作用研究尚未見報道。本研究以小鼠巨噬細胞（RAW264.7）為研究對象，探討朝天罐總酚對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應的作用，為深入研究朝天罐抗炎活性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1藥物 朝天罐采于廣西金秀瑤族自治縣，經廣西醫科大學天然藥物與生藥學教研室焦愛軍教授鑒定為野牡丹科植物朝天罐的根。采用課題組前期研究方法制備朝天罐總酚純化物[9]，臨用前以無菌培養基稀釋至所需濃度。

經計算，研究區內黑云母二長花崗巖巖石生熱率估算為3.23～12.34 μW/m2，平均值5.24 μW/m2，除孔深600 m處巖石生熱率突變外，整體上比較穩定，處于3.23～5.18 μW/m2，見圖2，其中U、Th和40K放射性產熱分別占巖石生熱率的30.84%、59.68%、9.48%，說明巖石生熱率主要依靠鈾釷貢獻，鉀貢獻率較小，研究區巖石生熱率高于世界范圍內花崗巖放射性生熱率平均值2.5 μW/m2，為高產熱花崗巖(HHP)。

1.2細胞和主要試劑 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院上海細胞庫。LPS（美國Sigma公司，批號：L2880）；地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，批號：503F051）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200617）；TNF-α、白細胞介素（IL）-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（Elabscience公司，批號：UGS26LDTHZ、ZMH73FDG6E）；中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：070720200930）。

1.3細胞培養和分組RAW264.7細胞用含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的高糖DMEM培養基，并置于5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養。將細胞分為正常對照組、模型組、陽性對照組及不同濃度（1.88μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL）朝天罐總酚組。模型組加入1μg/mL的LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，陽性對照組加入10μg/mL地塞米松，正常對照組不予處理。

單臥軸攪拌機是由德國公司開發的。雙水平軸攪拌機是隨著混凝土施工技術的逐步完善而發展起來的新型機型。國外從第二十世紀末開始在美國和德國，但軸封技術不成熟，其發展基本上處于停滯狀態。直到七十年代初，這項技術已形成了一系列產品。早在上世紀80年代中國的發展，但發展迅速，在產品說明書和產品的數量，都遠遠超過了其他模型。

反季節種植即是在植物的非正常栽植時間進行種植，其在一定程度上違背了植物的正常生長規律，如果在種植過程中技術處理不當、苗木選擇不當，那苗木的成活率就得不到保證。為有效提升苗木成活率，保證工程施工質量，在選擇苗木時應注意以下要點：

1.4 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的RAW264.7細胞以1.2×105個/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL。培養24 h后吸棄上清液，細胞分組處理后，置于5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養24 h；每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，繼續培養4 h，棄掉細胞培養液，每孔加入150μL DMSO，避光振搖10 min；用酶標儀測定490 nm波長處各孔的吸光度（OD）值，計算細胞存活率，即實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.6 NO含量檢測 取對數生長期RAW264.7細胞以2×105個/mL接種于6孔板中。培養24 h后吸棄培養基，細胞分組處理后，置于5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養24 h；收集細胞培養上清液，1 000 r/min離心5 min，取上清液；采用Griess法檢測細胞上清液中NO的含量，用酶標儀測定550 nm波長處各孔的OD值。檢測過程嚴格按照NO試劑盒說明書進行操作。

1.5 RAW264.7細胞吞噬功能檢測 取對數生長期RAW264.7細胞按1×106個/mL接種于96孔板，每孔200μL。培養24 h后吸棄培養基，細胞分組處理后，置于5%CO2、37℃的細胞培養箱中孵育24 h；棄上清液，PBS清洗，每孔加入200μL細胞培養基，并加入20μL中性紅染色液，繼續培養2 h；吸棄細胞培養基，PBS清洗，每孔加入200μL中性紅裂解液，于搖床上振搖10 min；用酶標儀檢測540 nm波長處各孔的OD值，計算吞噬指數，即實驗組OD值/空白對照組OD值。

2.4朝天罐總酚對LPS誘導RAW264.7細胞TNFα、IL-6含量的影響 與空白對照組比較，模型組細胞上清液中TNF-α、IL-6含量升高；與模型組比較，朝天罐總酚中、高劑量組細胞上清液中TNF-α含量降低，朝天罐總酚各劑量組IL-6含量降低，見表1。

2.1朝天罐總酚對LPS誘導RAW264.7細胞存活率的影響 不同濃度的LPS刺激RAW264.7細胞24 h后，細胞存活率在（100±10）%范圍內，可視為對細胞活力無影響。模型組與空白對照組細胞存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組比較，朝天罐總酚30μg/mL、60μg/mL組細胞存活率降低，而當朝天罐總酚濃度≤15μg/mL時，RAW264.7細胞存活率均高于90%，與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），可視為無細胞毒性，見圖1。

2.3朝天罐總酚對LPS誘導RAW264.7細胞NO含量的影響 與空白對照組比較，模型組細胞上清液中NO含量升高；與模型組比較，朝天罐總酚中、高劑量組和陽性對照組細胞上清液中NO含量降低，見圖3。

2 結果

潘國文曾說“中國人善形象思維，西方人善邏輯思維”，其中，形象思維就是我們常說的具體思維，而邏輯思維即抽象思維。由此看來，漢民族更注重具體思維，而西方民族更傾向于抽象思維。

建立促進融資租賃業發展的政策支持體系。引進融資租賃公司、設立分支機構，支持符合條件的各類資本設立融資租賃公司，提高融資租賃對經濟發展各行業的覆蓋面和市場滲透率[4]；支持設立專門面向中小微企業的融資租賃公司，發揮其融資便利、期限靈活、財務優化的優勢，提供適合中小微企業特點的產品和服務；鼓勵融資租賃公司加大對通用航空、支柱產業、教育醫療、現代農業、中小微企業等領域的支持力度，拓寬融資渠道。

圖1 不同濃度朝天罐總酚對LPS誘導RAW264.7細胞存活率的影響

2.2朝天罐總酚對RAW264.7細胞吞噬功能的影響 與空白對照組比較，朝天罐總酚（3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL）能增強RAW264.7細胞的吞噬能力（圖2），故選擇3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL作為低、中、高給藥濃度進行后續試驗。

圖2 不同濃度朝天罐總酚對RAW264.7細胞吞噬功能的影響

1.8統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖3 不同濃度朝天罐總酚對LPS 誘導RAW264.7 細胞NO含量的影響

1.7細胞上清液TNF-α、IL-6水平檢測 采用ELISA法測定細胞上清液中TNF-α、IL-6的含量，用酶標儀測定450 nm波長處各孔的OD值。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

表1 不同濃度朝天罐總酚對LPS 誘導RAW264.7 細胞TNF-α、IL-6含量的影響 ，n=3

表1 不同濃度朝天罐總酚對LPS 誘導RAW264.7 細胞TNF-α、IL-6含量的影響 ，n=3

與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

朝天罐主治腰膝酸軟、咯血、痢疾、咽喉痛等疾病，其根的主要化學成分為酚類和鞣質[12-13]。本課題組前期研究發現，朝天罐總酚具有較強的體外抗氧化、抗癌作用[9,14]。本研究發現，朝天罐總酚能夠提高LPS誘導的巨噬細胞增殖活性，減少細胞釋放TNF-α、IL-6，抑制細胞產生NO，增強細胞吞噬能力。由此表明，朝天罐總酚具有抗炎作用。

LPS是細胞內毒素的有效成分，是激活機體炎癥反應的重要誘導因子，其誘導的RAM264.7細胞炎癥模型是一種常用的炎癥反應模型[15-17]。在LPS的誘導下，RAW264.7細胞分泌大量炎癥因子如TNF-α、IL-6、NO等，這些炎癥因子將進一步活化RAW264.7細胞，從而加重炎癥反應[18]。巨噬細胞是一種免疫細胞，可通過吞噬功能及分泌多種細胞因子等參與機體的免疫應答，是機體免疫系統的重要組成部分[19-20]。NO是炎癥反應中的炎癥介質之一，隨著NO釋放量的升高，巨噬細胞吞噬能力也增強，吞噬指數可以反映吞噬功能的強弱，是衡量巨噬細胞活性的一個重要指標[21]。本研究結果顯示，朝天罐總酚可顯著減少LPS誘導的巨噬細胞NO、TNF-α、IL-6的分泌，這提示朝天罐總酚可能通過調節巨噬細胞促炎性細胞因子的水平以活化巨噬細胞，進而增強吞噬能力來發揮抗炎作用。

綜上所述，朝天罐總酚通過抑制炎癥因子的分泌和產生，增強巨噬細胞的吞噬功能發揮抗炎作用，這為中藥新藥開發和臨床應用提供了實驗依據，但關于朝天罐總酚的抗炎作用機制仍有待進一步研究。