干擾RIG-I表達對新城疫病毒誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7產生TRAIL、IL-6的影響*

李培群，鐘偉娟，梁 瑩，樊曉暉，張增峰

（廣西醫科大學基礎醫學院微生物學教研室，南寧 530021）

維甲酸誘導基因Ⅰ（retinoic acid induced gene I，RIG-I）是一種通過識別病毒核糖核酸來發揮效應的傳感元件，屬于RIG-I樣受體家族，是主要存在于細胞質中的模式識別受體之一。與病毒RNA發生特異性識別后，RIG-I可活化抗病毒免疫應答的信號通路，進而誘導免疫細胞產生大量炎癥因子和Ⅰ型干擾素[1-2]。RIG-I不僅在炎癥反應、免疫調節、吞噬等過程中有著廣泛的作用[3]，也在腫瘤發展進程的各階段中發揮著重要的調控作用[4]。巨噬細胞是天然免疫細胞的主要成員，依據細胞功能特征和分子表型，可以將活化的巨噬細胞分為多種亞群[5]，各亞群在腫瘤的發展中發揮重要作用[6]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）屬于副黏病毒科，其病毒核心為不分節段的單負鏈RNA。近年來，NDV因具有良好的抗瘤效果和對人體幾乎無毒的優勢，成為參與生物治療的溶瘤病毒家族成員。到目前為止，NDV的抗腫瘤機制尚未完全清楚，可能與抗腫瘤免疫應答的活化有關[7-8]。已有研究發現，NDV可以誘導巨噬細胞白介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的表達上調，從而增強巨噬細胞的殺瘤效應[9-10]。鑒于RIG-I是特異性識別病毒RNA的胞內信號傳導元件，其在NDV誘導巨噬細胞抗瘤效應的活化過程中是否扮演關鍵角色，目前尚未有相關報道。本實驗通過siRNA瞬時轉染法干擾小鼠巨噬細胞系RAW264.7的RIG-I基因表達，進一步研究RIG-I對NDV活化的小鼠巨噬細胞抗瘤因子TRAIL、IL-6表達的影響，為后續RIG-I與NDV的抗腫瘤免疫機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 小鼠巨噬細胞系RAW264.7由大理大學基礎醫學院生物化學教研室惠贈。NDV病毒WDK/JX/7793/2004株（簡稱為NDV7793）為本實驗室保存已有。RIG-I基因特異性siRNA引物siRNA-RIGI1、siRNA-RIGI2及siRNA-NC由上海吉瑪基因公司設計并合成。PCR引物由上海生工公司設計合成。Lipotectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM培養基、無血清DMEM培養基、胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司，TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ、總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自日本Takara公司，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 siRNA瞬時轉染用Lipotectamine 3000介導siRNA-RIGI1、siRNA-RIGI2或siRNA-NC轉染入小鼠巨噬細胞RAW264.7，設為siRNA-RIGI1組、siR-NA-RIGI2組和siRNA-NC組。siRNA-RIGI1上游序列：5’-GCAAGCAUUCAGAGACUAUTT-3’，下游：5’-AUAGUCUCUGAAUGCUUGCTT-3’；siRNA-RIGI2上游序列：5’-CCAGCAAUGAGAAUCCUAATT-3’，下 游：5’-UUAGGAUUCUCAUUGCUGGTT-3’；siRNA-NC上游序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

將RAW264.7細胞培養至對數生長期，在轉染前1 d，用含0.25% EDTA的胰酶消化、計數，按1×106個/孔的細胞密度接種至6孔板，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。用等體積的Opti-MEM培養基分別稀釋siRNA和Lipotectamine 3000，靜置5 min，將稀釋后的Lipotectamine 3000加至稀釋的siRNA中，充分混勻，室溫放置10～15 min，即可獲得包含siRNA和Lipotectamine 3000的轉染復合物（1∶1）。待細胞密度達到30%～50%時，除去原有培養基，更換不含FBS和雙抗的DMEM培養基，各孔加入等量siRNA和Lipotectamine 3000轉染復合物，輕輕振蕩混勻，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養6 h后，更換為不含雙抗、含10%FBS的DMEM培養基后繼續培養。

1.3分組方法 將小鼠巨噬細胞RAW264.7分為NDV組（加入血凝效價為1∶25的NDV7793）、PBS組（僅加入PBS）及空白組（不予處理），培養12 h。細胞轉染后繼續培養36 h，siRNA-RIGI1組、siRNARIGI2組分別加入NDV共培養12 h，即NDV+siRNA-RIGI1組、NDV+siRNA-RIGI2組。

1.4實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測TRAIL、IL-6mRNA表達Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，并以其為模板利用TB染料法進行PCR擴增。引物序列如下：RIG-I上游：5’-ATTGTCGGCGTCCACAAAG-3’，下游：5’-GTGCATCGTTGTATTTCCGCA-3’；TRAIL上游5’-ATGATGGTGATTTGCATAGTGC-3’，下游：5’-TTCATCTCGTTGGTGAAGTACA-3’；IL-6上游：5’-CTCCCAACAGACCTGTCTATAC-3’，下游：5’-CCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3’；GAPDH引物：5’-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3，下游：5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’。采用2-ΔΔCT法計算TRAIL、IL-6mRNA相對表達量。

1.5 ELISA法檢測TRAIL、IL-6含量 收集各組細胞培養上清液，檢測過程嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值。

1.6統計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NDV活化后細胞RIG-I、TRAIL及IL-6mRNA表達及細胞上清液中TRAIL和IL-6含量 與空白組或PBS組比較，NDV組RIG-I、TRAIL及IL-6mRNA表達上調，細胞培養上清液中TRAIL和IL-6含量升高，見表1、圖1。

圖1 NDV 活化后RAW264.7 細胞培養上清液中TRAIL和IL-6含量

表1 NDV活化后RAW264.7 細胞RIG-I、TRAIL和IL-6 mRNA相對表達量 ，n=3

表1 NDV活化后RAW264.7 細胞RIG-I、TRAIL和IL-6 mRNA相對表達量 ，n=3

與空白組比較，*P＜0.01；與PBS組比較，ΔP＜0.01。

2.2轉染siRNA后RAW264.7細胞中RIG-ImRNA相對表達量 與空白組或siRNA-NC組比較，siRNA-RIGI1組和siRNA-RIGI2組RIG-ImRNA相對表達量均降低，見圖2。

圖2 轉染siRNA后RAW264.7 細胞中RIG-I mRNA 相對表達量

2.3干擾RIG-I表達后RAW264.7細胞中TRAIL和IL-6mRNA表達及細胞上清液中TRAIL和IL-6含量與NDV組比較，NDV+siRNA-RIGI1組、NDV+siRNA-RIGI2組TRAIL和IL-6mRNA相對表達量降低，細胞培養上清液中TRAIL和IL-6含量降低，見圖3。

圖3 干擾RIG-I 表達后RAW264.7細胞中TRAIL和IL-6 mRNA表達及細胞上清液中TRAIL和IL-6的含量

3 討論

RIG-I也稱DDX58，最早由Liu等[11]通過對全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）誘導的急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）細胞分化過程中差異表達基因的大規模篩選中鑒定得出。RIG-I在非特異性免疫反應系統中對于識別病毒及清除病原體發揮著重要的作用。研究表明，RIG-I可以與病毒復制過程中產生的5’-三磷酸RNA及多種內源性RNA相結合[12]，活化位于線粒體膜表面的IFN-β 啟動子刺激器（IFN-βpromoter stimulator，IPS-1），介導Ⅰ型IFN的表達[13-14]，以達到識別和清除機體外源的病毒RNA的目的。除此之外，RIG-I在多種腫瘤（如黑色素瘤、結直腸癌等）發生發展的不同階段，通過增強凋亡誘導蛋白的表達以及下游信號通路的活化，進行抑癌或促癌調控[15]。由上可知，RIG-I作為一種存在于細胞質內的模式識別受體，在抗病毒免疫應答及腫瘤調控方面都發揮重要的作用。

另外，RIG-I在溶瘤病毒抗腫瘤機制中的作用在也有報道。在腫瘤細胞中，RIG-I信號通路的激活增強了腫瘤細胞對溶瘤病毒感染的耐受[16-18]。在免疫細胞中，作為危險信號的溶瘤病毒可以激活免疫細胞的抗腫瘤免疫應答，RIG-I分子起到信號傳遞的作用[19-20]。本研究中，溶瘤病毒NDV體外活化小鼠巨噬細胞RAW264.7，使抗瘤相關分子TRAIL、IL-6的基因表達上調；ELISA實驗結果表明，NDV活化RAW264.7細胞后，TRAIL、IL-6的細胞外表達水平升高。由于RIG-I是巨噬細胞識別病毒RNA后誘導下游抗病毒/抗腫瘤轉錄因子激活的信號元件，這意味著RIG-I不僅能與病毒RNA相結合，在天然免疫中發揮作用，而且還可能參與NDV激活巨噬細胞上調抗腫瘤因子表達的途徑。為此，本實驗利用siRNA瞬時轉染法對小鼠RAW264.7巨噬細胞的RIG-I基因進行干擾，隨后用NDV活化RIG-I干擾的細胞，結果顯示，干擾RIG-I表達后，NDV活化的RAW264.7細胞中TRAIL、IL-6mRNA相對表達量及細胞外表達水平均下降，因此可以推測巨噬細胞的RIG-I基因被干擾后，不能正常識別NDV，從而導致巨噬細胞中抗瘤的相關分子TRAIL、IL-6mRNA表達下調，推測RIG-I可能參與NDV活化巨噬細胞上調TRAIL、IL-6表達的過程。

綜上，沉默RIG-I基因可以抑制NDV活化小鼠巨噬細胞中TRAIL、IL-6基因的表達。由于考慮到瞬時轉染法獲得的RIG-I基因干擾細胞株無法傳代和保存，本課題組目前還利用慢病毒轉染技術構建RIG-I沉默的巨噬細胞株，該工作正在進行中。這些工作都將為后續RIG-I與NDV抗腫瘤免疫機制以及相關通路研究的實驗工作奠定基礎，同時也可能為NDV抗腫瘤相關研究和臨床免疫治療提供新的思路。