慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠血清中性粒細胞彈性蛋白酶與肺功能的相關性分析*

蘭靜，徐勁松，阮春花，夏國際

（江西省中國人民解放軍聯勤保障部隊第908醫院，南昌 330000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種破壞性肺部疾病，患病率及致死率均處于較高水平，其已成為嚴重的公共衛生問題[1]。COPD進入急性加重期可導致患者病情加重，肺功能隨之減弱，嚴重者甚至發生呼吸衰竭，危及生命[2]。因此，預防COPD急性加重期（acute exacerbation of COPD，AECOPD）發生是目前治療COPD的重要目標。有報道表明，COPD氣道黏液高分泌可引發患者管腔狹窄，這種病理變化與1 s用力呼吸容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）及FEV1/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）具有相關性，其可貫穿于COPD始終，尤以急性發作期最為明顯[3-4]。血清中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）參與COPD氣道黏液高分泌發生發展過程，其可導致肺組織結構受損并降解表面活性物質，亦可在多途徑介導下誘導黏蛋白產生[5-6]。研究證實，NE在刺激黏液產生及分泌中發揮重要作用[1]。然而，目前關于血清NE與AECOPD肺功能的研究較少。為此，本研究通過建立AECOPD大鼠模型，探究血清NE與肺功能的相關性。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組40只Wistar大鼠購于廈門大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（閩）2018-0003，體重180～220 g，所有大鼠均飼養于SPF級動物房中，溫度、濕度分別控制在22～24℃、50%～60%，均自由進食及飲水，并予以每12 h晝夜更替。

隨機抽取20只Wistar大鼠作為正常對照組，不作任何處理；余20只大鼠通過熏吸香煙及氣管內注射內毒素的方式建立COPD模型，建模成功后根據李建生等[7]AECOPD模型建立方法制備AECOPD模型，作為AECOPD組。

1.2材料與儀器 內毒素（上海安譜璀世標準技術服務有限公司生產）；哈德門香煙（上海卷煙廠生產）；金黃色葡萄球菌（北京安鑫康科技有限公司提供，菌號：ACTT25923）；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（北京強欣博瑞生物技術有限公司生產）；大鼠NE試劑盒（安徽澤升科技有限公司公司生產）；小動物肺功能儀（上海然哲儀器設備有限公司提供）；FLUOstar OPTIMA多功能酶標儀（香港伯齊科技有限公司提供）。

1.3 AECOPD模型構建 于實驗1～28 d（7 d、14 d、28 d除外）將大鼠放入密閉的有機玻璃倉，同時向玻璃倉中注入5%哈德門香煙煙霧，1次/d，30 min/次；于7 d、14 d、28 d 3個時間點，向大鼠氣管內注入0.2 mL 1 mg/mL內毒素建立COPD模型。COPD模型構建成功后，于實驗第29天向COPD大鼠模型鼻腔內注入0.3 mL金黃色葡萄球菌，2次/d，連續注入3 d構建AECOPD大鼠模型。

1.4蘇木精-伊紅（HE）染色觀察兩組大鼠肺組織病理形態變化 每組取5只大鼠斷頭處死，開胸后分離肺臟，然后采用5 mL 4%多聚甲醛固定大鼠兩側肺臟，48 h后將右肺取出經常規脫水、包埋后行切片處理，厚度約為5μm，經HE染色后置于顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態變化。

1.5大鼠體重的測定 分別于建模后0周、4周、8周、12周進行稱重，分析兩組大鼠體重變化。

1.6 ELISA法檢測兩組大鼠血清NE水平 每組取15只大鼠，采用40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經下腔靜脈取血5 mL，然后置于離心機中以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液采用ELISA法檢測大鼠血清NE水平，嚴格按照NE試劑盒說明書步驟操作，并采用多功能酶標儀于550 nm波長處對吸光度進行檢測，所得吸光度值按照標準曲線計算NE水平。

1.7肺功能檢測 兩組大鼠均于下腔靜脈取血完成后采用小動物肺功能儀檢測吸氣阻力（inspiratory resistance，Ri）、最大通氣量（maximal voluntary ventilation，MVV）、0.3 s用力呼吸容積（FEV0.3）/FVC及呼氣峰流速（peak expiratory fowl rate，PEF）。

1.8統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用Pearson相關性分析法分析AECOPD大鼠血清NE與肺功能指標的關系，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1兩組大鼠肺組織病理形態學分析 正常對照組肺組織未見明顯變化，肺泡結構完整，排列整齊，氣管和支氣管黏膜纖毛完整無脫落，未見明顯炎性細胞浸潤；AECOPD組肺泡結構明顯破壞，肺泡壁變薄，肺泡腔不規則擴大，周圍可見炎性細胞浸潤，氣道黏膜上皮杯狀細胞增生，管壁纖維組織增生，支氣管上皮細胞壞死、脫落，見圖1。

圖1 兩組大鼠肺組織病理形態學分析（HE染色，×100）

2.2兩組大鼠體重比較AECOPD組大鼠體重增長速度較正常對照組慢，且在8周、12周時AECOPD組大鼠體重低于正常對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠體重比較 g，

表1 兩組大鼠體重比較 g，

2.3兩組大鼠血清NE及肺功能指標比較AECOPD組血清NE水平與Ri均較正常對照組升高，MVV、FEV0.3/FVC、PEF均較正常對照組降低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠NE及肺功能指標比較

表2 兩組大鼠NE及肺功能指標比較

2.4 AECOPD大鼠血清NE與肺功能的相關性分析經Pearson分析，AECOPD大鼠血清NE與Ri呈正相關關系（r=0.530，P=0.003），與MVV（r=-0.456，P=0.011）、FEV0.3/FVC（r=-0.395，P=0.031）、PEF（r=-0.554，P=0.002）呈負相關關系，見圖2。

圖2 AECOPD大鼠血清NE與肺功能的相關性分析

3 討論

AECOPD起病急驟，病情進展迅速，患者通常表現為發熱、咳喘加劇、痰量增加、痰液黏度或顏色異常等，是導致COPD患者肺功能下降的重要因素[8-9]。AECOPD發生機制較復雜，臨床尚未發現可有效治療該疾病的藥物及方法，治療難度較大[10]；除此之外，AECOPD呈進行性發展，隨著病情的加重，氣道阻力升高，可進一步引發呼吸肌疲勞及氣體交換異常，加速肺功能下降，亦可導致肺動脈高壓、肺心病等，嚴重威脅患者生命健康，給家庭及社會帶來沉重的經濟負擔[11]。

合理的動物模型作為探索疾病的橋梁及有效手段，對多種疾病臨床狀態的探究具有重要價值[12]。熏吸香煙及氣管內注射內毒素的方式建立COPD模型已經得到臨床學者廣泛認可[13]，故本研究通過該方式成功構建COPD大鼠模型，且在此基礎上采用鼻腔內注入金黃色葡萄球菌的方式構建AECOPD模型發現，由病理學角度來看，正常大鼠未見明顯變化，AECOPD大鼠出現部分肺組織實變，肺泡結構破壞、纖維增生及炎性細胞浸潤等，其肺組織病理學變化與人類AECOPD病理表現相符，可進行后續實驗。并且AECOPD組大鼠體重增長速度較正常對照組慢，且在8周、12周時AECOPD組大鼠體重低于正常對照組，說明AECOPD作為慢性消耗性疾病多存在營養缺失，體重減少已成為該疾病常見表現。

氣道黏液可有效抵御外來有害物質入侵，然而氣道黏液過度分泌可導致黏液潴留、黏液纖毛清除功能異常等，進而導致氣道阻塞及反復感染[14]。中性粒細胞可在肺內聚集并通過釋放多種促炎因子而引發NE大量分泌，并進一步加重氣道阻塞[15]。中性粒細胞活化后可促進NE分泌，而NE是一種破壞性極強的彈性蛋白酶，其可導致組織炎癥反應，已被證實與COPD起病及進展密不可分[16]。當COPD進入急性加重期，NE活性明顯上，這與中性粒細胞導致的炎癥反應關系緊密[17]。目前已有報道表明，COPD患者氣道分泌物中主要是NE大量聚集，而NE可促進AECOPD氣道黏液高分泌[18]。汪強等[19]研究發現，AECOPD患者血清NE、高遷移率族蛋白-1水平均較COPD穩定期患者及健康老年人群顯著升高，說明AECOPD患者體內存在炎癥反應，且肺組織可能受到嚴重損傷；除此之外，穩定期患者血清NE、高遷移率族蛋白-1水平亦較健康老年人群升高，說明COPD患者處于穩定期體內亦出現慢性炎癥反應，可繼續損傷肺組織；兩種因子持續作用可能是連續不斷地氣道炎癥及氣道重塑，是引發肺組織破壞的重要機制。肺功能指標是臨床判斷AECOPD患者通氣障礙和氣流受限的重要方法，可為臨床判斷患者病情改善情況提供依據[20]。本研究結果顯示，AECOPD組血清NE水平與Ri均較正常對照組升高，MVV、FEV0.3/FVC、PEF均較正常對照組降低。這與李杰等[12]研究結果相一致，AECOPD大鼠血清NE水平升高，提示其體內可能存在一定程度慢性炎癥反應，可誘導急性加重期氣道黏液高分泌，并導致肺組織破壞。經Pearson分析，AECOPD大鼠血清NE與Ri呈正相關關系，與MVV、FEV0.3/FVC、PEF呈負相關關系，說明NE可影響AECOPD肺功能，與肺功能進行性下降密切相關，推測NE影響AECOPD肺功能的作用機制可能為：NE作為一種極強的促黏液分泌物質，其可通過促進氣道黏蛋白表達及黏液釋放而引發氣道炎癥時黏液高分泌狀態的產生，此時氣道內黏液過度增加，氣道阻塞進一步加重，可形成嚴重的氣流受限，最終導致AECOPD肺功能持續下降。

綜上，AECOPD血清NE水平升高與AECOPD肺功能持續下降密切相關。