沙奎那韋對脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠PI3K-AKt-NF-κB信號通路的影響*

何達(dá)，張莉，席俊峰

（榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，榆林 719000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種破壞性的呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是肺泡快速受損、低氧血癥嚴(yán)重、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子積累，之后會發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），嚴(yán)重時可致死[1]。近年來，大規(guī)模臨床試驗和研究集中在ALI/ARDS上，使其在治療策略方面取得了重大進(jìn)展。然而，其臨床死亡率仍居高不下[2]。目前，探究并開發(fā)有效的候選預(yù)防治療藥物仍然是ALI/ARDS治療研究的主要焦點(diǎn)。

沙奎那韋（saquinavir，SQV）是一種HIV蛋白酶抑制劑，能夠抑制HIV蛋白酶的生物活性，終止HIV病毒的復(fù)制。SQV是一種安全性的藥物。除了抗病毒活性外，SQV對癌癥、炎癥和免疫介導(dǎo)疾病等也有良性作用[3-5]。已有研究表明，SQV能夠改善肝臟缺血再灌注引起的遠(yuǎn)處肺組織損傷，其能改善肺水腫，并能降低模型中炎癥反應(yīng)的水平[6]。ALI發(fā)展為ARDS的原因之一可能始于炎癥反應(yīng)[7-8]，其中NF-κB信號通路是炎癥因子的主要調(diào)控通路。研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路與NF-κB信號通路存在聯(lián)系，Akt磷酸化活化IKK，導(dǎo)致NF-κB的抑制劑IKB下調(diào)，當(dāng)IKB下調(diào)，NF-κB不再與之結(jié)合，于是后者從胞質(zhì)被釋放，然后進(jìn)入核內(nèi)并引起相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而介導(dǎo)多種生長因子等誘發(fā)的細(xì)胞生長，并經(jīng)多種途徑促調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等[9-10]。表明PI3K/Akt通路與其他因素共同作用，增加NF-κB通路的激活[11-12]，從而調(diào)控了細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等。本研究利用大鼠建立脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)的ALI模型來觀察SQV在ALI中的抑制炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡作用，并探討其可能機(jī)制，為ALI/ARDS的預(yù)防治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1實驗材料SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠36只，體重230～300 g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心；沙奎那韋（CAS號：127779-20-8）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；蘇木精—伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自北京索萊寶生物科技公司；TUNEL染色試劑盒購自瑞典Roche公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的ELISA檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBa、GAPDH抗體購自美國Cell Sigaling公司。

1.2 LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型與分組 造模前，所有SD大鼠在干凈通風(fēng)的動物房環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，期間恒定晝夜循環(huán)（12 h∶12 h），定時補(bǔ)充食物和水。按照隨機(jī)選擇方法將大鼠分為3組，即對照組（Control組）、LPS模型組（LPS組）、SQV處理的LPS模型組（LPS+SQV組），每組12只。參考文獻(xiàn)[12]的方法對LPS+SQV組大鼠在LPS造模前5 d予以200 mg/kg·d-1的SQV灌胃處理，每天1次，連續(xù)5 d，而對Control組與LPS組大鼠則采取等體積的生理鹽水灌胃處理。第5天參考文獻(xiàn)[6,13]的方法對LPS組和LPS+SQV組大鼠采用腹腔注射5 mg/kg的LPS制備ALI模型；造模12 h后，腹腔注射120 mg/kg戊巴比妥處死大鼠，進(jìn)行后續(xù)實驗。實驗方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 HE檢測肺組織病理學(xué)變化 將肺組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋和切片處理，切成4μm厚度。組織切片載于載玻片上，二甲苯脫蠟，分級乙醇稀釋和蒸餾水復(fù)水，按照HE試劑盒說明書染色。光鏡下觀察肺組織病理切片，并分析病理學(xué)變化。

1.4肺組織濕/干比重測定 戊巴比妥處死大鼠后，取左肺上葉，肺表面的水用濾紙吸干，對樣品進(jìn)行準(zhǔn)確稱重，記為濕重（W）。將其放入恒溫烘干箱中，設(shè)置溫度為75℃，烘烤至樣品恒重，然后記錄稱量數(shù)據(jù)為干重（D）。計算肺組織濕/干比重（W/D）比值，評價肺組織水腫程度。

1.5 TUNEL染色檢測肺組織細(xì)胞凋亡取4%甲醛固定后的肝組織，石蠟包埋切片至4μm后，脫蠟處理后0.2%Triton X-100透化10 min，加入50μmol/L的TUNEL試劑于37℃下避光孵育30 min，37℃下DAPI試劑染核6 min，最后在激光共聚焦顯微鏡下，隨機(jī)選擇視野觀察TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)（×400）。

1.6 ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中炎癥相關(guān)因子的含量 建模后12 h后，戊巴比妥麻醉各組大鼠，切開頸部分離出氣管，插管后用無菌PBS灌洗3次，將灌洗液-80℃保存?zhèn)溆谩⑹占降闹夤芊闻莨嘞匆喝〕觯凑誆LISA檢測試劑盒說明書操作，通過使用設(shè)備檢測在450 nm處吸光度值，測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量變化

1.7 Western blotting檢測肺組織蛋白 取大鼠左肺組織加入裂解液勻漿，提取總蛋白質(zhì)。采用BCA法測定提取物的蛋白濃度。用SDS-PAGE對蛋白進(jìn)行分離，之后轉(zhuǎn)在PVDF膜上，脫脂牛乳封閉1 h，并使用一抗p-PI3K（1∶800）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶800）、Akt（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶800）、NF-κBp65（1∶1 000）、IκBa（1∶200）和GAPDH（1∶1 000）4℃過夜進(jìn)行孵育，之后用山羊抗兔二抗37℃孵育2 h，之后使用Image J軟件進(jìn)行Western blotting定量分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并作圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。每組實驗至少進(jìn)行3次重復(fù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SQV改善LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI肺組織切片HE染色結(jié)果顯示，與Control組正常肺組織比較，LPS組肺泡間質(zhì)充血、肺泡間隔增厚、炎性細(xì)胞浸潤，能觀察到明顯的病理性變化；而LPS+SQV組中，肺組織的病理情況明顯改善，肺泡間隔增厚減少，間質(zhì)充血減少；在W/D測定結(jié)果中，與Control組比較，LPS組和LPS+SQV組W/D比值增加；而LPS+SQV組W/D比值較LPS組降低，見圖1。

圖1 SQV對LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織的影響

2.2 SQV改善LPS誘導(dǎo)的肺組織細(xì)胞凋亡與Control組比較，LPS組和LPS+SQV組細(xì)胞的凋亡上升；與LPS組比較，LPS+SQV組肺組織細(xì)胞凋亡降低,見圖2。

圖2 TUNEL染色觀察SQV對LPS誘導(dǎo)各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況（×400）

2.3 SQV改善LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)LPS組和LPS+SQV組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量較Control組均增高。與LPS組比較，LPS+SQV組大鼠IL-10的含量升高，而TNF-α、IL-1β、IL-6的含量卻均下降，見圖3。

圖3 SQV對LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織中炎癥因子含量的影響

2.4 SQV影響LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織中PI3KAKt-NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化水平

與Control組比較，LPS組IκBa的表達(dá)水平下降，LPS+SQV組IκBa的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而LPS組和LPS+SQV組PI3K磷酸化水平（p-PI3K/PI3K）、AKt磷酸化水平（p-AKt/AKt）、NF-κB p65的磷酸化水平（p-NF-κB p65/NF-κB p65）均升高；而與LPS組比較，LPS+SQV組IκBa的表達(dá)水平升高，其它檢測蛋白的磷酸化水平下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 SQV對LPS誘導(dǎo)大鼠肺組織中PI3K-AKt-NF-κB通路蛋白表達(dá)與磷酸化的影響

3 討論

ALI/ARDS是一種以低氧血癥和呼吸功能不全為特征的綜合病癥，現(xiàn)存的治療策略雖然緩減了ALI/ARDS的發(fā)展，但年致死率仍達(dá)40%。為了尋找更為有效的預(yù)防治療方法，本研究利用大鼠建立LPS誘導(dǎo)的ALI模型來觀察SQV在ALI中的抑制炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡作用，以期為ALI/ARDS的預(yù)防治療提供依據(jù)。

LPS是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，被認(rèn)為是ALI/ARDS發(fā)生的關(guān)鍵因素。暴露于LPS環(huán)境，能導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，隨后導(dǎo)致ALI/ARDS炎癥反應(yīng)的啟動和傳播，加快病情的惡化[15]。并且，LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠模型更接近于人體由于長期低氧血癥和某些形式的肺損傷導(dǎo)致的病理改變。本研究選擇以5 mg/kg的劑量腹腔注射LPS，創(chuàng)建ALI模型。HE檢測結(jié)果表明，模型中存在嚴(yán)重的組織病理，同時，肺組織W/D的比值升高也說明，LPS誘導(dǎo)的ALI導(dǎo)致了肺組織的病理性水腫。而連續(xù)5 d予以SQV處理可減少模型組織病理損傷。提示SQV持續(xù)處理可減輕組織病理學(xué)損傷，緩解ALI的發(fā)展。

炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡是肺損傷模型中典型的病理特征。NF-κB是炎癥反應(yīng)的重要通路，而PI3K-AKT是NF-κB的上游通路。其中，Akt是重要分子，在促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的ALI/ARDS的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[16-17]。Akt可靶向核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控多個基因的表達(dá)，而這些基因是導(dǎo)致多種炎癥疾病進(jìn)展的重要因素。探索影響這些信號通路的候選藥物可能是幫助預(yù)防和治療LPS誘導(dǎo)ALI的關(guān)鍵一步。

炎癥反應(yīng)在肺損傷進(jìn)展中起重要作用[18]。TNF-a主要由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞激活、產(chǎn)生和釋放，是一種強(qiáng)大的炎癥介質(zhì)。研究表明，TNF-a具有增加肺泡毛細(xì)血管通透性，減少肺泡內(nèi)液體清除率的能力，與IL-1β、IL-6[19]具有類似的作用。而IL-10可抑制中性粒細(xì)胞激活，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，保護(hù)肺組織免受損傷[20]。在本研究LPS誘導(dǎo)的ALI中，TNF-a、IL-1β、IL-6促炎因子的表達(dá)異常升高，抑制炎癥因子IL-10相對低表達(dá)，并且從模型能觀察到明顯的病理性變化。既往研究表明，SQV可以抑制NF-κB通路相關(guān)因子的活化[21-22]，從而在多種疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究也證實了SQV處理后可顯著抑制促炎因子TNF-a、IL-1β和IL-6的表達(dá)，增加IL-10的表達(dá)。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥因子[23]表達(dá)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。本研究還檢測了IκBa的表達(dá)和NF-κB p65蛋白的磷酸化。結(jié)果與以往研究一致，SQV通過抑制NF-κB p65蛋白磷酸化，減少了過量細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，SQV可以通過NF-κB途徑抑制LPS誘導(dǎo)大鼠促炎癥因子的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡是肺損傷的另一個關(guān)鍵特征，已有研究表明，通過調(diào)控PI3K-AKT-NF-κB信號通路影響肺組織細(xì)胞的炎癥和凋亡，從而改善肺損傷情況[24]。表明抗凋亡可能是保護(hù)肺損傷的另一機(jī)制。本研究研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)ALI后，觀察到大量凋亡細(xì)胞，且PI3K蛋白磷酸化、Akt蛋白磷酸化、NFκB p65蛋白磷酸化水平均升高，說明PI3K-AKT-NF-κB通路被激活；SQV處理過的大鼠，肺組織中PI3K蛋白磷酸化、Akt蛋白磷酸化、NF-κB p65蛋白磷酸化水平及凋亡指數(shù)均明顯降低。說明SQV通過抑制LPS攻擊細(xì)胞凋亡改善肺組織病理損傷，即抑制PI3K-AKT-NF-κB通路可修復(fù)LPS對肺組織造成的損傷。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的ALI中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡之間存在聯(lián)系。

綜上所述，SQV對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI有保護(hù)作用。其機(jī)制可能是SQV通過抑制PI3K-AKT-NFκB信號通路，降低細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)而緩減ALI。因此，SQV可能是ALI/ARDS期間預(yù)防和治療的一種有前途的藥物，這將為ALI/ARDS的預(yù)防和治療提供新的治療策略和方向。