基于網絡藥理學和分子實驗探討蝙蝠葛堿對鼻咽癌的作用機制*

白先愚，郭興喆，成南南，楊萌哲，周守常，覃柳潔，黃元姣，林文珍,2△

（1.廣西醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，南寧 530021；2.廣西高校生物分子醫學研究重點實驗室，南寧 530021；3.廣西醫科大學生命科學院，南寧 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國最常見的頭頸惡性腫瘤，也是我國南部地區最典型的惡性腫瘤中的一種[1]。在廣西，NPC是排名在第4位的惡性腫瘤，發病人群越來越年輕化，對于局部進展期NPC患者，傳統治療是以順鉑為基礎的同步放、化療，其局部控制率高達80%以上[2]，但由于大部分患者就診時就處于中、晚期，患者整體預后很差[3]，放療后還會出現復發、轉移，且放、化療常有殺傷正常細胞等反應及較嚴重的并發癥[4]。所以，尋求對NPC有良好效果且副作用較小的治療藥物迫在眉睫。

蝙蝠葛（別名北豆根）為防己科植物，性味苦寒，其根、莖、葉及果實均有藥用價值。蝙蝠葛堿（Dauricine）是從蝙蝠葛的根莖中分離提取而得到的一種中藥單體。研究表明，蝙蝠葛堿對NPC CNE-1細胞及CNE-2Z細胞[5]以及HL60、K562等腫瘤相關細胞具有顯著抑制作用[6-7]，但其對NPC的作用機制尚不清楚。為此，本實驗利用網絡藥理學的方法預測蝙蝠葛堿對NPC的潛在靶點及相關通路信息,并用體外實驗進行驗證，以尋證防治NPC的新靶點及有效防治藥物，為蝙蝠葛藥材的開發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物和試劑

人NPC CNE2細胞系購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫，NPC CNE2細胞在37℃、5%CO2的培養箱中培養，培養液為含1%青—鏈霉素混合液、10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，當細胞培養生長至80%時，用0.25%含EDTA的胰酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。蝙蝠葛堿（貨號：DB0023），成都德斯特生物科技有限公司。PI3K小鼠單克隆抗體（貨號：67071-1-Ig）、AKT小鼠單克隆抗體（貨號：60203-2-Ig），美國Proteintech公司；BCA法蛋白含量檢測試劑盒（貨號：P0010），上海碧云天生物科技有限公司；熒光小鼠二抗（貨號：SA5-35521），美國Invitrogen公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒10%（貨號：PG112），上海雅酶生物醫藥科技有限公司。CCK-8試劑盒（貨號：CK04），上海東仁化學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8檢測蝙蝠葛堿對CNE2細胞增殖的影響 取對數生長期的CNE2細胞，用0.25%含EDTA的胰酶進行消化處理，重懸為單細胞懸液，以5 000個/孔接種于96孔培養板中，在37℃、5%CO2的培養箱中貼壁12 h，小心地吸出培養液，分別加入含蝙蝠葛堿的培養基100μL，濃度梯度為5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L（最高濃度的DMSO含量為0.05%），對照組加入相同體積含0.05%DMSO的完全培養基，每組設3個復孔。在37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h、48 h、72 h后，吸出含蝙蝠葛堿的培養基，用PBS清洗2次，按照CCK-8使用說明書，每孔加入100μL RPMI-1640培養基和10μL CCK-8，于37℃、5%CO2的培養箱中孵育90 min。用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的吸光度（A），計算不同濃度蝙蝠葛堿對細胞的抑制率并繪制細胞增殖的抑制率曲線。實驗重復3次。細胞抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%，As：實驗孔（含有細胞的培養基、CCK-8、毒性物質），Ac：對照孔（含有細胞的培養基、CCK-8、沒有毒性物質），Ab：空白孔（不含細胞和毒性物質的培養基、CCK-8）。

1.2.2化合物及NPC靶點的查詢及篩選在Pubchem數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索Dauricine 3D結構，并將其3D結構文件導入到Pharmmapper數據庫中（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）篩選得到蝙蝠葛堿靶點。在GeneCards數據庫（http://www.genecards.org/）搜索NPC靶點。通過venn在線平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對藥物和疾病靶點取交集。

1.2.3蝙蝠葛堿與NPC靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的網絡可視化構建及分析String數據庫（https://string-db.org/）是一個搜尋蛋白質與蛋白質之間相互作用的數據庫，其旨在提供PPI的評估和集成。將通過維恩取交集得到的基因輸入String數據庫構建PPI網絡。將得到的PPI網絡輸入Cyto-scape 3.7.2軟件進行可視化。軟件中的Network Analysis plugin對可視化圖中的節點進行統計，并根據度值的大小而區分節點的生物功能。

1.2.4 GO功能和KEGG pathway通路富集及化合物—靶點—通路網絡圖構建

David數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）是一套完整的功能注釋在線工具，供研究者理解大量基因背后的生物學意義。將藥物與NPC靶點交集輸入David數據庫進行KEGG、GO功能注釋分析。制作靶點—通路—藥物之間的關系網絡，導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“蝙蝠葛堿—NPC疾病靶點”網絡圖。

1.2.5 Western blotting檢測靶蛋白表達 取對數生長期的CNE-2細胞，倒置顯微鏡下觀察計數，調整細胞密度為2×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL，置于培養箱貼壁培養24 h，藥物分組處理細胞結束后，收集細胞，各實驗組細胞用預冷的PBS緩沖液清洗3次，收集細胞后，加入預冷的細胞裂解液裂解細胞，混勻，超聲破壞細胞器結構；超聲后的細胞用4℃低溫離心機以12 000 r/min離心15 min，上清液轉移到新的EP管中并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液按5∶1比例稀釋并混合后 煮沸5 min，SDS-PAGE進行150 V恒壓電泳70 min，將凝膠上的蛋白濕轉至0.45μm的PVDF膜上（270 mA恒流65 min），5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST清洗3次后分別加入相應一抗（1∶1 000），置于4℃冰箱孵育過夜，TBST漂洗3次，室溫下加入二抗（1∶20 000）孵育1.5 h，TBST清洗3次后進行ECL顯色。用凝膠成像分析系統分析電泳條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算和分析目的蛋白質的表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蝙蝠葛堿對CNE2細胞增殖的影響

與對照組比較，加藥組隨著蝙蝠葛堿濃度的升高及作用時間的延長，CNE2細胞增殖抑制率明顯升高，作用24 h、48 h、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為81.6μmol/L、26.2μmol/L、20.8μmol/L，見圖1。

圖1 蝙蝠葛堿對CNE2細胞增殖的影響

2.2 蝙蝠葛堿治療NPC潛在靶標預測

將蝙蝠葛堿的3D結構導入到Pharmmapper數據庫篩選出Z>0的靶點，得到118個靶點。在GeneCards數據庫搜索NPC靶點1 788個靶點。通過venn在線平臺取交集，得到69個靶點，見圖2。

圖2 蝙蝠葛堿與NPC相關靶點韋恩圖

2.3 蝙蝠葛堿治療NPC共有基因PPI網絡圖

將69個交集靶位信息輸入STRING數據庫,可以得到蝙蝠葛堿—NPC靶點的PPI圖，將其結果輸入Cytoscage3.7.2程序，可以得到蛋白質的相互作用的網絡關系圖（圖3）。網絡中包括了69個節點和513條邊，該網絡布局是根據節點的Degree水平按順時針方向從小到大梯度排序，綠色節點代表蝙蝠葛堿在NPC中的潛在靶點，節點中間的線表示與不同蛋白質間相互作用有關，光度值最高的前18個節點（表1）。其中該網絡中度值最大的靶位是ALB，度值約為50，其次是AKT1、EGFR、MMP9、SRC、CASP3等，其中度值更多的靶蛋白可能是蝙蝠葛堿防治NPC的重要靶點。

圖3 PPI網絡圖

表1 蝙蝠葛堿治療NPC潛在靶點

2.4 KEGG 通路富集分析及化合物—靶點—通路網絡圖構建

用David的KEGG通路富集分析,共得到了75條通道。以P≤0.001為水準,篩選出與NPC相關的前13條通路（表2）。結果顯示，在pathways in cancer、PI3K-AKT信號通路、proteoglycans in cancer和prolactin signaling pathway等通路上富集較多（圖4）。利用蝙蝠葛堿與通道的關聯,以及通過藥物與蛋白之間的關系,來構建“蝙蝠葛堿-靶點-通道”的網絡圖（圖5）。網絡共包括91個節點和370條邊。

圖4 蝙蝠葛堿KEGG通路富集圖

圖5 蝙蝠葛堿-靶點-通路網絡圖

表2 蝙蝠葛堿KEGG高富集通路

2.5 GO功能注釋

將維恩網站交集出的69個共同靶點導入到David數據庫選擇GO功能富集分析，以P≤0.001為水準，共篩選出140個與GO富集相關條目。包含了94條相關生物進程和16條相關細胞組成和30條相關分子功能，按照P值升序排列結果顯著富集的條目（圖6）。結果表明，分子功能涉及蛋白質結合、ATP結合、相同蛋白質結合等；生物過程包括凋亡過程涉及細胞凋亡負調控、蛋白水解、肽基酪氨酸磷酸化等；涉及細胞核、細胞質、胞質溶膠等與細胞組成相關。

圖6 蝙蝠葛堿GO功能注釋

2.6 蝙蝠葛堿對PI3K及AKT蛋白的影響

用30μmol/L蝙蝠葛堿作用CNE2細胞24 h，收集細胞提取蛋白進行Western blotting檢測，結果表明，PI3K、AKT蛋白表達量低于空白對照組（P＜0.01），見圖7。

圖7 蝙蝠葛堿對CNE2細胞PI3K-AKT通路蛋白的影響

3 討論

NPC的臨床化療藥物以鉑類為主，放療為輔，最常用的藥物為順鉑，但其不良反應嚴重降低了患者的生存質量及治療依從性[8]，具有一定的局限性。中藥單體是從傳統中藥中分離的單一化合物，因其機制明確，便于研究，受到國內外廣泛關注。有研究表明，青蒿素可以通過下調TGF-β信號通路抑制乳腺癌的增殖和轉移[9]，紫杉醇是中藥紅豆杉樹皮的提取物，獲得美國食品和藥物管理局批準，可以用于治療乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及卡波濟氏肉瘤[10]。基于中藥單體在腫瘤防治中突出的療效和優勢，尋找有效治療腫瘤的中藥單體，成為目前的研究熱點[11]。

蝙蝠葛堿是從蝙蝠葛的根莖中分離提取而得到的一種中藥單體，課題組前期的CTG實驗結果顯示，蝙蝠葛堿處理后的CNE-2細胞的發光強度低于未處理的CNE-2細胞的強度，提示蝙蝠葛堿可抑制CNE-2細胞的生長，進一步的CCK-8實驗也表明蝙蝠葛堿可抑制CNE-2細胞的增殖，其48 h的IC50為26.2μmol/L。多數研究也發現，蝙蝠葛堿能明顯抑制包括NPC細胞在內的多種腫瘤細胞的增殖[5,7,12-13]，這些結果表明，蝙蝠葛堿可抑制NPC細胞的生長，但其作用機制尚不清楚。

網絡藥理學為現代藥物研發提供了一種新的方法，大大節省了時間和成本[14]。本研究篩選出能用于治療NPC的69個潛在靶點。將這69個交集靶點導入String數據庫進行分析，發現ALB、AKT1、EGFR、MMP9、SRC、CASP3、ESR1、HSP90AA1等這些度值較高的靶蛋白可能是蝙蝠葛堿治療NPC的關鍵靶點。KEGG通路富集分析表明，與NPC相關度最高的通路為癌癥信號（pathways in cancer）、PI3K-AKT信號、癌癥蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、催乳激素信號（prolactin signaling pathway）等通路。進一步的蝙蝠葛堿-靶點-通路網絡圖的結果顯示，PIK3CG、AKT1、GRBL等度值較高，是蝙蝠葛堿治療NPC的關鍵靶點基因。這些結果表明，PI3K-AKT信號通路是蝙蝠葛堿作用于NPC的關鍵通路。此外，GO富集分析表明生物過程和功能主要富集于凋亡過程、負調控調控、蛋白水解、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白質結合和ATP結合。細胞凋亡是細胞正常發育中必不可少的過程[15]。癌細胞會逃避細胞凋亡并形成腫瘤[16]。蛋白質水解是指蛋白質在水解酶的催化作用下水解過程的統稱。這一過程所形成的水解產物在人體內要比自由氨基酸和沒有水解的蛋白質更易于吸收。蛋白水解酶是這一過程的主要參與部分，有研究表明，一系列的蛋白水解酶在凋亡過程中起到重要作用[17]。這些結果提示蝙蝠葛堿可能通過PI3K-AKT信號通路調節細胞凋亡。

PI3K-AKT信號通路參與細胞增殖、分化、遷移、凋亡和血管生成等過程，在非小細胞肺癌、胃癌和肝癌等多種癌癥中發揮關鍵作用，也是NPC發生發展的重要調節通路之一。生長因子、細胞因子、激素、缺氧等細胞外信號刺激可激活PI3K。AKT是PI3K的重要下游分子，兩者相互協同作用，共同發揮著促進增殖、抑制凋亡的作用。當PI3K被激活后,細胞膜內表面的PIP2受到催化，生成PIP3并作為第二信使，激活AKT。當AKT被激活后，線粒體途徑的Bcl-2也被激活，進而起主導作用。Bcl-2含有BH4結構域和TM，主要錨定在線粒體外膜，可以在很多細胞中阻斷細胞色素C從線粒體中釋放以及防止Caspase凋亡蛋白的激活。Wang等[18]的研究顯示，通過雷公藤甲素作用于NPC C666-1細胞后，PI3K和AKT的活性降低，同時，Bcl-2的表達減少，Caspase3的活性也降低，最終導致凋亡的發生。本研究結果表明，蝙蝠葛堿可抑制CNE2細胞的生長，并能下調PI3K和AKT蛋白的表達，表明蝙蝠葛堿對NPC細胞中PI3K和AKT蛋白產生了抑制作用,與網絡藥理學研究的預測結論相符，即蝙蝠葛堿能阻斷PI3K-AKT信號通路控制NPC細胞的生長。

網絡藥理學的預測結果顯示，蝙蝠葛堿可調節細胞凋亡。但蝙蝠葛堿是否通過PI3K-AKT信號通路調節細胞凋亡，還需要進一步的實驗進行驗證。

綜上，本研究通過網絡藥理學、細胞實驗、分子實驗等對蝙蝠葛堿治療NPC進行了多維度、多層次的研究和比較分析，發現蝙蝠葛堿對NPC的作用靶點及可能的作用機制，為NPC藥物的研發奠定了基礎。