基于網絡藥理學探討驅風止痛散治療急性痛風性關節炎的作用及其機制*

郭思彤，譚思濤，梁小玲，黃菊，劉麗敏△

（1.廣西壯族自治區人民醫院藥學部，南寧 530021；2.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021）

急性痛風性關節炎（AGA）是一種常見的炎性疾病，以高尿酸血癥和關節或/和組織內尿酸鈉（MSU）結晶為特征[1]。隨著生活方式和飲食結構的改變，導致全球范圍內痛風的發病率逐年上升[2]。目前痛風并無治愈方法，臨床治療主要以緩解癥狀和預防復發為主，常用藥物有秋水仙堿、糖皮質激素、別嘌呤醇和苯溴馬隆等[3]。以上藥物雖在控制癥狀方面有效，但存在副作用較大且停藥后易復發等問題[4]。因此，迫切需要開發更有效、副作用更小的治療痛風藥物。

我國中醫理論認為痛風是由濕熱內蘊、血阻氣機、氣滯血瘀所致。驅風止痛散（QFZTS）由腎茶（Clerodendranthus spicatus）、車前草（Plantaginis Herba）、牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）、蒼術（Atractylodis Rhizoma）和菟絲子（Cuscuta chinensis）組成，在民間常用于痛風的治療。方中以腎茶為君藥，功能清熱去濕，排石利尿；車前草利尿、除濕、清熱、涼血，牛膝生用活血通經，熟用可補肝腎，強腰膝，菟絲子滋補肝腎、固精縮尿，三者輔助君藥清熱祛濕、活血通經，共為臣藥；蒼術可燥濕、化濁、止痛，用作佐藥。諸藥配伍應用，共奏利水消腫、滋補肝腎、強筋健骨、消腫止痛之功效，但其作用機制尚不明確[5-9]。本研究通過網絡藥理學方法系統分析QFZTS治療AGA的藥物靶點和關鍵通路，并通過構建大鼠AGA模型探討QFZTS對AGA的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 QFZTS活性成分及其相關靶點的篩選 采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索QFZTS相關的所有化學成分，根據藥物動力學和毒理學，選取口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為初篩參數，再將篩選后得到的化合物成分經過Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）比對，檢索文獻補充已驗證靶點，最終獲取QFZTS活性成分的基因靶點。

1.2 AGA潛在靶標的獲取 分別以OMIM數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）挖掘AGA相關基因，將2個數據庫檢索的結果進行整合，刪除重復項后得到AGA的相關靶點。將得到的疾病靶點與藥物靶點取交集，獲取其二者的共同靶點基因，為QFZTS作用于AGA的潛在靶點。

1.3靶點蛋白互作網絡與可視化網絡的構建與分析 將疾病靶點與藥物靶點取交集提交至STRING11.0數據庫（https://string-db.org）構建蛋白—蛋白相互作用（PPI）網絡模型[10]，設定生物物種為人類，最低相互作用閾值取最高“highest confidence（≥0.9）”，其余設置均為默認設置，得到PPI網絡，并通過CytoScape3.7.1中的hubba插件對PPI網絡進一步分析篩選度值最佳的前20個靶點，得到潛在的關鍵靶點基因，并通過分析其參與的生物學進程對其功能進行描述。

1.4 QFZTS治療AGA的基因本體及通路富集分析 為了分析和獲得目的基因的主要功能和通路富集，采用Cytoscape軟件的ClueGO插件，對QFZTS治療AGA的靶點關聯KEGG數據庫中的信號通路，分析QFZTS治療AGA的通路。

1.5實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（桂）2020-0002。本研究動物實驗及處置嚴格按照動物倫理學要求進行。

1.6藥物和試劑QFZTS（廣西壯藥方醫院，批號：20180908）；秋水仙堿片（西雙版納藥業公司，批準號：H53021369）、MSU（Aladdin公司，批 號：20211113）。白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉化生長因子（TGF）-β1酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（江萊生物）；RNAiso Plus、RNA逆轉錄及定量擴增試劑盒（寶日醫生物技術有限公司）。

1.7實驗分組和造模將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、秋水仙堿組（6×10-4 g/kg）及QFZTS高、中、低劑量組（6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg），每組10只。適應性喂養7 d后，按照體重分別灌胃給予不同濃度的QFZTS、秋水仙堿和蒸餾水（模型組），1次/d，連續給藥7 d。給藥第4天，使用滅菌注射器將MSU混懸液（25 mg/mL）注入踝關節腔內，以關節囊對側鼓起為標準，誘導AGA模型，空白組關節腔內注入生理鹽水[11]。

1.8血清炎癥因子含量測定 造模72 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，腹主動脈采血，離心，取上清。采用ELISA法檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平。

1.9踝關節滑膜組織病理學觀察10%福爾馬林溶液固定大鼠關節，EDTA脫鈣液脫鈣，常規脫水、透明，石蠟包埋、切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察踝關節滑膜組織病理學變化。

1.10 RT-qPCR法檢測炎性小體（NLRP3）、Caspase-1、IL-1β mRNA表達 取踝關節周圍軟組織，提取總RNA，BCA法測定濃度，逆轉錄合成cDNA，行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸31 s，共40個循環。引物由由寶工公司設計并合成，引物序列如下，IL-1β上游：5’-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3’，下游：5’-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3’；Caspase-1上游：5’-GACCGAGTGGTTCCCTCAAG-3’，下游：5’-GACGTGTACGAGTGGGTGTT-3’；NLRP3上游：5’-GCTGTGTGAGGCACTCCAG-3’，下游：5’-GAAACAGCATTGATGGGTCA-3’；GAPDH上游：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。以GAPDH作為內參基因，采用2-△△CT計算目的基因相對表達量[12]。

1.11統計學方法用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QFZTS藥物靶點 通過TCMSP數據庫篩選腎茶、車前草、牛膝、蒼術、菟絲子，潛在的活性化合物，結合化學專業數據庫，補充有效成分及其靶點，得到QFZTS有效成分45個及其對應靶點254個。

2.2 AGA疾病靶點 通過GeneCards數據庫檢索“Acute Gouty Arthritis”，設定相關性分數＞3，并通過檢索OMIM數據庫補充獲得AGA疾病相關靶點192個。

2.3 QFZTS治療AGA的PPI網絡構建及靶點篩選

通過將QFZTS藥物靶點與AGA疾病靶點交集信息（圖1A）導入STRING數據庫，設定生物物種為人類，構建PPI網絡，發現其產生直接及間接作用的基因33個，靶點與靶點相互關系247個，見圖1B。用Cytoscape軟件的hubba功能篩選PPI網絡得到QFZTS治療AGA相關度最高的前20個基因靶點，包括絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、基質金屬蛋白酶3（MMP3）、白介素-8（CXCL8）、C反應蛋白（CRP）、一氧化氮合酶2（NOS2）、IL-1β、NLRP3、胱天蛋白酶1（CASP1）、過氧化物酶體增殖激活受體-γ（PPARG）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、IL-6、纖溶酶原激活物抑制因子1（SERPINE1）、淀粉樣β 前體蛋白（APP）、TNF、血紅素加氧酶1（HMOX1）、核轉錄因子p65（RELA）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、TGF-β1、趨化因子2（CCL2），見圖1C。

圖1 QFZTS-AGA基因靶點匹配

2.4 KEGG通路分析 采用Cytoscape軟件的ClueGO插件對QFZTS治療AGA的靶點進行KEGG數據庫通路分析，結果顯示：QFZTS治療AGA可影響腫瘤、炎癥免疫反應和氧化還原反應，具體與IL-17、糖基化終末期受體（AGE-RAGE）、TNF、核苷酸結合寡聚域受體（NOD）和核因子（NF）-κB等相關信號通路，見圖2A。對QFZTS治療AGA的相關靶點進行信號通路分析，并對結果可視化，見圖2B。

圖2 關鍵靶點和通路富集分析

2.5各組大鼠血清炎癥因子水平比較 與空白組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1含量升高；與模型組比較，秋水仙堿組及QFZTS高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1含量下降，QFZTS中劑量組IL-6、TNF-α 水平降低，QFZTS低劑量組IL-6含量降低，見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較 pg/mL，，n=10

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較 pg/mL，，n=10

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.6踝關節滑膜組織切片病理組織結果 空白組踝關節滑膜組織完整，上皮細胞排列緊密整齊，未見異常炎癥細胞；模型組踝關節滑膜組織增生，滑膜中有大量炎性細胞浸潤；秋水仙堿組炎癥細胞和組織增生減少；QFZTS各劑量組滑膜增生情況均有不同程度的改善，炎性細胞浸潤減少，軟骨侵蝕性損傷減輕，見圖3。

圖3 大鼠踝關節滑膜組織病理變化（HE，×200）

2.7各組踝關節周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達比較 與空白組比較，模型組踝關節周圍軟組織NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達上調；與模型組比較，秋水仙堿組及QFZTS高、中劑量組NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達下調，見表2。

表2 各組踝關節周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較 ，n=10

表2 各組踝關節周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較 ，n=10

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

隨著生物信息學的快速發展，網絡藥理學已被證明是探索中醫藥的有力工具，能提供對藥物作用和疾病復雜性的系統理解和藥理學模型，有助于剖析中草藥對特定疾病的作用[13]。本研究成功構建了QFZTS與AGA的中藥復方靶點—疾病靶點網絡，通過對靶點與疾病靶點的映射，預測潛在機制通路富集，并在進一步的動物試驗中，驗證了QFZTS藥理作用的預測通路。

本研究PPI網絡分析顯示，IL-1β、IL-6、TNF、CCL2、MMP9、NLRP3、CASP1、PTGS2、TGF-β1是頂部節點重要靶點，KGEE結果顯示，IL-17、AGERAGE、TNF、NOD樣受體和NF-κB等信號通路與QFZTS治療AGA潛在作用機制密切相關。以上結果從理論機制層面上證明QFZTS通過多組分、多靶點、多途徑的方式發揮治療AGA的作用。

AGA是由關節腔內尿酸濃度過高形成MSU晶體而引起的。MSU晶體被組織中巨噬細胞識別，觸發機體固有免疫反應，誘發炎癥聯級反應，導致嚴重關節炎癥，過度和不間斷的炎癥會損害健康組織，最終導致軟骨變性和關節損傷[14]。在這個過程中，大量炎癥因子和細胞內容物的釋放被認為是AGA發病的關鍵[15]。同時，結合網絡藥理學結果可知，QFZTS治療AGA機制可能與IL-17、TNF和NOD等炎癥信號通路密切相關。此外，已有研究證實，MSU可通過一系列反應促進NLRP3炎性小體形成，NLRP3通過激活Caspase-1和IL-1β，激活NOD受體家族信號通路進而誘導痛風炎癥[16]。綜合考慮現有研究所揭示NLRP3在痛風性關節炎等炎癥疾病發病中的重要性，本課題組認為NOD樣受體信號通路中NLRP3、Caspase-1、IL-1β靶點可能是QFZTS在AGA治療中的關鍵。

NOD樣受體蛋白—NLRP3炎性小體可被多種病原體和危險因子激活，其中MSU是常見的危險因子之一[17]。激活的NLRP3通過ASC激活pro-Caspase-1，活化Caspase-1將pro-IL-1β 切割成IL-1β，而IL-1β是痛風性關節炎中調節細胞分化、增殖和凋亡的關鍵炎癥介質，可誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，如TNF-α、IL-6和IL-8的釋放[18]。本研究顯示，經QFZTS治療后，MSU誘導的AGA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著下降；滑膜組織損傷較模型組減輕，滑膜增生受到抑制，炎癥反應明顯減弱；NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達受到抑制。初步證實，QFZTS能有效緩解MSU引起的AGA，其可能通過干預NOD樣受體信號通路，下調NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，抑制炎癥反應，與網絡藥理學預測結果相一致。

TGF-β1是由成熟巨噬細胞分泌產生的一種多功能細胞因子，主要通過阻礙內皮細胞活化，降低白細胞黏附聚集，激活炎癥信號通路，進而促進炎癥因子釋放[19]。MSU晶體在關節腔內沉積后，刺激TGF-β1過度分泌，從而激活TAK1，促進MKK激酶激活P38MAPK磷酸化，活化的P38MAPK可誘導下游NF-κB信號通路的高表達，最終促進IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1等炎癥因子的活化，加重關節炎癥損傷[20]。結合網絡藥理學和體內實驗結果可知，NFκB信號通路為QFZTS和AGA共同信號通路，且關聯度高，QFZTS干預后的AGA大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平下降，提示TGF-β1/P38MAPK/NF-κB通路可能是QFZTS治療AGA的另一途徑，仍需通過實驗進一步驗證。

本研究采用網絡藥理學聯合動物體內實驗分析了QFSTS治療AGA的作用機制，初步證實QFZTS可通過調節NOD樣受體信號通路，抑制NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1的釋放，從而減輕炎癥反應。