METTL3/miR-126調控TGF-β1/smad2對高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖的影響*

張靜，張 潔，莫 穎，張 蕾，孫明慧

（新疆醫科大學第五附屬醫院腎病科，烏魯木齊 830000）

糖尿病腎臟病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病患者最嚴重、最普遍的并發癥之一，可導致患者死亡，也是終末期腎病（ESRD）的主要促成因素[1]。DKD有多種形態改變，包括系膜細胞肥大和增殖、腎小管細胞上皮—間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、足細胞凋亡等[2]，其中腎小管細胞EMT是引起腎功能損害最常見的原因[3]。DKD的易感因素包括遺傳、代謝機制紊亂、高血糖、胰島素抵抗、血流動力學改變、炎癥反應、氧化應激等[4]。有研究表明，糖尿病患者存在“遺留效應”，表觀遺傳因素在該效應中起到重要作用[5-6]。

腺嘌呤第6位氮原子上發生的甲基化修飾（m6A）是真核生物mRNA中最常見的甲基化修飾[7]。類甲基化轉移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）是構成m6A甲基轉移酶復合體的核心組分，負責催化RNA發生m6A修飾[8]。在2型糖尿病中，葡萄糖調節METTL3介導的m6A修飾，然而，METTL3在糖尿病相關疾病調控中的作用存在爭議[9]，METTL3與DKD發病機制之間的關系仍不清楚。METTL3還可以介導m6A修飾調控miRNA表達[10]。有研究表明，多種miRNA在DKD發病機制中發揮重要作用[11]。其中miR-126參與糖尿病的發生和發展，在DKD中的表達下調，但具體作用機制尚不清楚[12-13]。本研究旨在探討METTL3對高糖（HG）誘導的大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）和大鼠腎小球系膜細胞（HBZY-1）增殖的影響及其作用機制，并闡明METTL3與miR-126的相互作用，為探索DKD新的治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與培養 大鼠NRK-52E細胞和大鼠HBZY-1細胞均購自武漢Procell公司。將NRK-52E細胞和HBZY-1細胞轉移到含有10%胎牛血清（FBS）和1%青—鏈霉素DMEM培養基的離心管中，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，用含10%FBS的完全培養基懸浮細胞；將細胞接種到培養皿中，輕輕吹打混勻，置于37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養箱中培養，間隔2 d更換1次培養液。細胞融合度達到約80%時，胰酶消化，傳代，取第3代細胞用于實驗。

1.2主要試劑FBS、青—鏈霉素、酚紅（Gibco，美國）；MTT試劑盒（BioFroxx，德國）；TIANScript RT Kit、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根，中國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，中國）；smad2抗體、METTL3抗體（Proteintech，中國）；GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG（Bioswamp，中國）；轉化生長因子（TGF）-β1酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（Cusabio，中國）；RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit（Millipore，美國）。

1.3細胞分組和轉染 取對數生長期、生長狀態良好的NRK-52E和HBZY-1細胞，按3×105個/孔接種于96孔板，分為對照組、高糖（HG）組、HG+siRNA陰性對照（siRNA-NC）組和HG+METTL3 siRNA組。采用LipofectamineTM 2000分別轉染siRNA-NC和si-METTL3，細胞于37℃、CO2培養箱中培養，6 h后吸出轉染液換入正常培養，繼續培養24 h。對照組用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養基培養24 h，其他各組用含有35 mmol/L葡萄糖的培養基培養24 h。METTL3的siRNA序列由擎科生物生物科技有限公司合成，序列如下：METTL3 siRNA1：5’-GUCUAUAGUCCUGAAUUATT-3’；METTL3 siRNA2：5’-GUUGAUUGAGGUAAAGCGATT-3’；METTL3 siRNA3：5’-GGAAUUGGGCAGAGAAU GUTT-3’。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期、生長狀態良好的HBZY-1和NRK-52E細胞，以4×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后，每孔加入10μL MTT溶液，繼續培養4 h，棄去培養基，加入150μL DMSO震蕩10 min，酶標儀測定568 nm波長處各孔的吸光值（OD）。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期 用不含EDTA的0.25%胰酶消化處理細胞，終止消化后收集細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次；1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細胞，緩慢加入700μL預冷的80%乙醇；4℃條件下固定4 h，1 500 r/min離心5min，預冷PBS洗滌2次；加入100μL RNase，37℃水浴30 min；加入400μL PI，4℃避光染色30 min；用流式細胞儀在激發波長488 nm波長處檢測紅色熒光。

1.6 RT-qPCR法檢測METTL3和miR-126表達

通過DNAMAN軟件設計METTL3、β-actin、miR-126、U6熒光實時定量PCR引物，并由擎科公司合成。METTL3引物上游：5’-TAAGCCCAGCACAACGTCTA-3’，下游：5’-CAACTCCTGGGCAGCA AATT-3’；miR-126引物上游：5’-TGCGCTCGTACCGTGAGTAATA-3’，下 游：5’-CCAGTGCAGG GTCCGAGGTATT-3’；U6引物上游：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下 游：5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’；β-actin引物上游：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下 游：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA。PCR反應體系：上、下引物10 μmol/L各0.4μL，2×SYBR Select Master Mix 10μL，RNase-free水4.8μL，cDNA模板4μL，50×ROX Reference Dye 20.4μL，配制成20μL體系混合均勻。PCR反應條件：在ABI（QuantStudio 6）儀器上保持95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，延展95℃，15 s，40個循環。采用2-ΔΔCT方法計算METTL3和miR-126相對表達量。

1.7 Western blotting法檢測METTL3和smad2蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗smad（1∶3 000）、METTL3（1∶3 000）、GAPDH（1∶1 000）稀釋液4℃下孵育過夜；洗膜，加入HRP標記二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL顯色，在暗室中壓片、曝光、顯影，用Band Scan分析條帶灰度值。

1.8細胞上清液中TGF-β1含量檢測 收集各組細胞培養上清液，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測細胞上清液中TGF-β1含量，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.9 RNA免疫共沉淀技術（RIP）采用RIP實驗探討miR-126和METTL3之間的結合情況。RIP分析使用Magna-RIP RNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒（Magna RIP Kit，Millipore）。測定抗體的總RNA（輸入對照）和同型對照（IgG）。RT-qPCR法檢測共沉淀RNA。提取細胞中總RNA，并使用Ribo-Zero磁性試劑盒（Illumina）去除核糖體RNA。用RNA裂解試劑（Ambion）對核糖核酸進行裂解。使用之前在RIP免疫沉淀緩沖液中與磁性Dynabeads結合的抗m6A抗體（Synaptic Systems，202003）進行RNA免疫沉淀，并與片段RNA孵育。經蛋白酶K（10 mg/mL）處理后，用苯酚/氯仿/異戊醇提取RNA，用miR-126引物進行RT-qPCR驗證。

1.10統計學方法 所有數據采用SPSS 25.0軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 METTL3 siRNA轉染效果及其對HG誘導的NRK-52E和HBZY-1細胞增殖的影響METTL3 siRNA1組、METTL3 siRNA2組、METTL3 siRNA3組METTL3 mRNA表達均下調，且siRNA1效果最佳，見圖1。因此選擇siRNA1作為后續轉染片段。NRK-52E和HBZY-1細胞中，HG+METTL3 siRNA組增殖活性均較HG組提高，且METTL3 siRNA對NRK-52E細胞的促增殖作用較明顯，見表1。因此選擇NRK-52E細胞進行后續實驗。

圖1 RT-qPCR法驗證3條METTL3 siRNA轉染效果

表1 METTL3 siRNA對HG誘導的NRK-52E和HBZY-1細胞增殖的影響 ，n=3

表1 METTL3 siRNA對HG誘導的NRK-52E和HBZY-1細胞增殖的影響 ，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

2.2 METTL3 siRNA對HG誘導的NRK-52E細胞周期的影響HG+METTL3 siRNA組G1期細胞所占百分比較HG組降低，而S期細胞所占百分比較HG組升高，HG+siRNA-NC組與HG組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表2。

圖2 各組細胞周期比較

表2 METTL3 siRNA對HG誘導的NRK-52E細胞周期的影響 ，n=3

表2 METTL3 siRNA對HG誘導的NRK-52E細胞周期的影響 ，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

2.3 METTL3 siRNA可抑制HG處理的NRK-52E細胞TGF-β1、smad2及miR-126表達 與對照組比較，HG組METTL3、smad2蛋白表達及TGF-β1水平升高；與HG組比較，HG+METTL3 siRNA組MET-TL3、smad2蛋白表達及TGF-β1水平降低；HG組與HG+siRNA-NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表3。

表3 METTL3 siRNA對NRK-52E細胞TGF-β1、METTL3、smad2及miR-126表達的影響 ，n=3

表3 METTL3 siRNA對NRK-52E細胞TGF-β1、METTL3、smad2及miR-126表達的影響 ，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

圖3 Western blotting蛋白電泳圖

2.4 METTL3與miR-126的相互作用RIP結果顯示：METTL3 siRNA可降低HG處理的NRK-52E細胞miR-126的成熟能力，見圖4。表明METTL3可通過結合miR-126發揮作用。

圖4 RIP實驗驗證METTL3與miR126的相互作用

3 討論

m6A修飾包括甲基化轉移酶（METTL3、METTL14等）、去甲基化轉移酶（FTO）和識別蛋白（YTH家族）[14]。本研究發現，HG誘導的NRK-52E細胞中METTL3表達量較對照組顯著升高，而METTL3 siRNA轉染的細胞METTL3表達水平下降。提示HG刺激可提高甲基轉移酶的表達，同時說明RNA甲基化可能調控DKD發病機制。本研究中，HG誘導的細胞增殖活性顯著降低，通過siRNA抑制METTL3表達后，細胞增殖活性明顯升高。細胞周期中G1期為DNA合成前期，S期為DNA合成期，G2為DNA合成后期。本研究結果顯示，METTL3 siRNA使得G1期細胞減少，S期和G2期細胞增加，表明沉默METTL3可促進HG誘導的NRK-52E細胞DNA復制，加快細胞周期進程，促進細胞分裂，這與細胞增殖率升高的結果相一致。

在DKD的病理生理過程中，腎纖維化是一個終點事件，主要特征為ECM蛋白的過度表達[15]。腎小管上皮細胞是DKD纖維化的主要來源，可以通過TGF-β1來調控[16]。而TGF-β1是DKD纖維化的重要生長因子之一，能引起細胞凋亡、肥大、表型轉換、ECM積累等[17]。TGF-β1介導的信號通路主要為TGF1/smad信號通路，該通路的激活誘導腎小球硬化和腎小管間質纖維化。本研究表明，TGF-β1、smad2在HG組中的表達量顯著升高，而這種表達變化可以被METTL3 siRNA抑制。提示METTL3 siRNA可能通過阻斷TGF1/smad2信號通路抑制HG誘導的NRK-52E細胞纖維化。

miRNA可被METTL3以m6A修飾依賴的方式調控，METTL3可影響miRNA的成熟，METTL3表達升高會增加miRNA含量，從而激活相關信號通路，促進疾病的發生和發展[18]。本研究發現，在HG環境下細胞miR-126的表達量升高，METTL3 siRNA明顯降低miR-126的表達量。為了進一步揭示METTL3與miR-126之間的相關性，本研究采用RIP實驗，針對目標蛋白的抗體將相互作用的miR-126和METTL3蛋白復合物沉淀下來，經過分離純化對結合在復合物上的miR-126進行分析，結果表明METTL3可以特異性靶向miR-126并影響其表達。

綜上所述，METTL3在HG誘導的腎小管上皮細胞中的表達上調，抑制細胞增殖，其可能的作用機制為METTL3甲基化修飾miR-126，激活TGF-β1/smad2信號通路。本研究為DKD的機制研究提供了新的方向。