基于微生物學的速食食品致病菌檢驗研究

王 輝，張 亮，周美靜

（保定市疾病預防控制中心，河北 保定 071000）

目前，食品安全因為與人們的生活和健康息息相關，已經成為全社會廣泛關注的熱點話題。為了確保食品的安全性，還需要做好相應的微生物檢驗工作。隨著時代的發展，人們的生活水平不斷提高，食品的種類也日漸豐富，相應地，食品安全問題也更加受到重視。速食食品具有口味繁多、方便快捷等特點，在人們的日常生活中十分常見，帶給大家極大的便利。但是，速食食品也容易受到污染，出現各種致病菌。為此，針對各種速食食品，還需要重視相關的致病菌檢驗。目前，在檢驗過程中，可以選擇應用不同的檢驗方法。在本文的研究中，選擇200份含有食源性致病菌的速食食品樣本進行隨機分組，分別采用傳統細菌分離培養法和實時熒光定量PCR 法進行檢驗。通過比較不同檢驗方法的效果，得出較為合理的檢驗方案。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

此次實驗用標準菌株及其來源于編號情況如表1所示。

表1 實驗用標準菌株及其來源于編號情況Tab.1 Source and number of experimental standard strain

1.2 試劑和儀器

此次研究中使用的試劑以及儀器種類分別為：細菌基因組DNA提取試劑盒（廣東環凱微生物科技有限公司生產）；PCR 擴增試劑盒（杭州妙麗生物技術有限公司生產）；沙門氏菌核酸檢測試劑盒（北京奧博星生物技術有限責任公司生產）；副溶血弧菌核酸檢測試劑盒（廣州深華生物技術有限公司生產）；金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（上海創坤生物科技有限公司生產）；志賀氏菌核酸檢測試劑盒（上海滬震生物科技有限公司生產）；單核細胞增生性李斯特菌核酸檢測試劑盒（廣州華峰生物科技有限公司生產）；蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（上海富勒生物科技有限公司生產）；熒光定量PCR 儀（中山大學達安基因股份有限公司生產）；臺式高速冷凍離心機（力康生物醫療科技控股有限公司生產）。

1.3 方法

采用傳統分離鑒定方式進行檢驗，包括：前增菌、選擇性增菌、平板分離、生化篩選、血清學鑒定。在檢驗過程中，根據分離培養后不同致病菌的化學組成情況或者代謝產物類型，結合其不同的生理生化等特性，開展生化反應實驗，動物毒理實驗，溶血實驗，對不同的致病菌予以鑒定。

（1）菌株基因組DNA 制備

選取不同培養基上的單個菌落，嚴格依照不同細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進行操作，按照操作流程，將不同菌株的基因組DNA提取出來，提取完畢后，置于-20℃條件下凍存備用，作用是陽性對照。

（2）樣本前處理與DNA 提取

對200份速食食品樣品進行處理，于無菌條件下，取25.0 g 食品樣品均質，將其添加到已經經過滅菌處理的液體培養基（225 mL）中。之后，置于37℃條件下開展增菌培養，連續培養24 h。培養結束后，取50 μL 增菌液進行DNA 提取。針對不同菌株的情況，選擇相應的核酸檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明進行操作，完成檢測。

（3）實時熒光定量PCR 反應體系及程序

將食品提取的DNA以及不同菌株的DNA 作為模板，利用特異性引物與探針進行PCR 擴增。研究PCR 擴增梯度循環反應相關循環數與反應時間、反應溫度如表2所示。

表2 研究PCR 擴增梯度循環反應相關循環數與反應時間、反應溫度Tab.2 The number of relevant cycles, reaction time and reaction temperature of studying PCR amplification gradient cycle reaction

（4）陽性結果判定

在完成反應之后，對結果進行判定。其中，如果待測樣品檢測所得循環閾值（cyclethreshold,Ct值）小于等于35，且存在明顯的指數增長情況，則證明PCR過程中出現目標DNA 的擴增。在空白對照結果、陽性對照結果、陰性對照結果均正常的情況下，可將其判定為陽性。如果檢測所得的Ct 值在35~38的范圍之內，則需要重新進行PCR 擴增操作。對再次擴增后的外源基因Ct 值進行觀察，如果該數值仍然大于35，且存在明顯的指數增長現象，在空白對照結果、陽性對照結果、陰性對照結果均正常的情況下，可將其判定為陽性。如果經過再次擴增操作后，外源基因的Ct 值高于38，在空白對照結果、陽性對照結果、陰性對照結果均正常的情況下，可將其判定為陰性。

1.4 觀察指標

對兩種檢驗方法下的致病菌陽性檢出情況進行統計，相關的致病菌包括計算出總陽性率。并對兩組檢驗所耗費的時間進行記錄，計算出平均用時結果。

1.5 統計學處理

對研究過程中采集到的各項數據進行匯總，統一導入到統計學軟件 SPSS 21.0中進行出處理。研究中涉及到的各種計量資料均以均數±標準差形式表示，組間的統計學檢驗采用檢驗，各項計數資料的表示方法為例，%，組間檢驗采用卡方檢驗。檢驗后實現（＜ 0.05），則證明組間差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同檢驗方法的陽性檢出率統計比較

經統計與組間比較，實時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統細菌分離培養法的8.00%明顯較高（＜ 0.05），具體統計結果如表3所示。

表3 不同檢驗方法的陽性檢出率統計比較Tab.3 Statistical comparison of the positive detection rate with different detection methods

2.2 不同檢驗方法的平均用時統計比較

對比不同檢驗方法下的用時情況，可得實時熒光定量PCR 法的平均用時明顯短于傳統細菌分離培養法（＜ 0.05），具體統計結果如表4所示。

表4 不同檢驗方法的平均用時統計比較Tab.4 Statistical comparison of average time with different detection methods±s/h

3 討論

長期以來，食品安全一直都是備受社會各界關注的重要課題。食源性疾病是公認的、全球首要的食品安全問題，也是首要的公共衛生問題。食品微生物檢測的3大指標是菌落總數、大腸菌群、致病菌，食品中常見的致病菌有沙門氏菌，變形桿菌，副溶血性弧菌，致病性大腸桿菌，蠟樣芽孢桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌等。食品中的致病菌、污染物（真菌毒素）對消費者健康危害較大。近年來，各種致病菌污染所引起的食源性疾病時有出現，嚴重威脅到公眾的健康，也造成了一定的經濟損。確保食品安全的關鍵，在于采取有效的方法，快速篩查受污染的食物。

隨著經濟的快速發展，生產模式、生產規模甚至消費習慣均發生變化，再加上我國特有的飲食文化，目前，各種不同類型、不同口味的速食食品在人們的生活中十分常見，給大家的日常生活提供了極大的便利。但是，速食食品的制作、加工、包裝、運輸、貯藏等過程中極易被各種致病菌所侵染，進而影響到食品的質量和安全，并直接威脅到廣大消費者的身體健康，甚至是生命安全。為此，針對各種速食食品，應注意從微生物角度出發，重視對其相關致病菌的檢驗和分析。在具體的檢驗過程中，可以選擇應用不同的檢驗方法。以往在進行檢驗的時候，應用的大多是傳統細菌分離培養法。應用這一方法進行檢驗的過程中，需要結合檢驗需求，對各種致病菌進行培養。培養過程中，不同微生物所需的生長環境條件也各不相同，為獲得理想的培養效果，還需要針對不同微生物的特點進行相應的培養基選擇和溫度、酸堿度控制等等。例如：腸出血性大腸桿菌0157∶H7可以利用與一般大腸桿菌發酵山梨醇的特性不同，在SMAC瓊脂上為無色菌落，而一般大腸桿菌為粉紅色菌落來鑒別腸出血性大腸桿菌0157∶H7。整個過程操作十分繁瑣，復雜，并需要耗費大量的人力、物力。而且，傳統培養方法下，對于那些不容易被培養出來的致病菌，往往難以進行檢測。另外，檢驗所耗費的時間也較長。

目前食物致病菌的檢查通過增菌培養→分離培養→確認試驗，整個過程需要7~14 d的時間，周期長，操作繁瑣，已不適應時代發展的需要。因此，開發快速、靈敏的食源性致病菌檢測方法至關重要。隨著時代的發展，各種新型的檢驗技術手段開始被開發出來，并逐漸應用到各種食品的致病菌檢驗之中。聚合酶鏈式反應（PCR）是一種快速、靈敏、高通量的方法，目前已經被廣泛地應用于多種食源性致病菌的快速檢測之中。熒光定量PCR(Real-Time PCR）技術即是在PCR反應體系中加入熒光物質，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，對未知模板進行定量分析的方法。具有應用范圍廣、靈敏度高、操作簡便、特異性和可靠性更強、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點。細菌的PCR檢測流程主要包括核酸提取、擴增和檢測，目前，不同的PCR方法，包括常規PCR、實時PCR、多重PCR、免疫PCR和微流控PCR等，均有文獻報道應用于各種細菌檢測。

在本文的研究過程中，選擇應用實時熒光定量PCR 技術。該技術是一種新型的檢驗技術，傳統的檢測方法操作繁瑣、準確度不高，實時熒光定量PCR方法是基于基因的方法，比傳統的檢驗方法更準確、快速。與傳統定量檢驗不同，傳統的檢驗方法只能進行重點檢驗，而采用全封閉管分析的實時熒光定量PCR技術可以借助一定的電腦分析軟件對PCR 擴增產物的實時動態地進行監測和自動定量分析。在檢驗過程中，應用該技術，可以根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針，從細胞或特定組織中提取總RNA。之后，使用設計合成的引物，以一定的樣品為模板，進行Real Time PCR反應，確認引物模板的反應性能，制作標準曲線，并進行定量分析。在實時熒光定量PCR(qPCR）中，反應以循環中首次檢測到目標擴增的時間點為特征，而非在一定循環數后目標分子累積的擴增量。因此，整個檢驗和分析的過程十分方便、快捷、高效，極大地提高了檢測的效率和精密度以及靈敏度。在本文的研究中，選擇應用實時熒光定量PCR技術對速食食品的致病菌情況進行檢驗。在檢驗過程中，選擇了一些常見的食源性致病菌進行研究，包括蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生性李斯特菌、志賀氏菌，以及金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等等。在研究中，對所獲得的200份速食食品樣品進行了檢測，檢測中應用不同的檢測方法，并對檢測結果進行了分析。通過分析發現，在樣本陽性檢出率方面，實時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統細菌分離培養法的8.00%明顯較高。這一結果表明，與傳統細菌分離培養法相比較，應用實時熒光定量PCR法可以更好地對各種陽性標本予以檢出，檢驗的精確度更高。另外，不同檢驗方法在所消耗時間方面也存在一定的差異。此次研究中，對比不同檢驗方法下的用時情況發現，實時熒光定量PCR 法的平均用時為（2.35±0.12）h，明顯短于傳統細菌分離培養法的（37.35±0.15）h。由此可知，實時熒光定量PCR 法是一種高效、方便、快捷的檢驗方法，在提高檢驗效果的同時，也可以有效縮短檢驗所需時間，這對提高實際工作中的致病菌檢驗效率意義重大。但是，在具體的應用過程中，實時熒光定量PCR 技術、也具有一定的缺陷和不足。例如，該方法的檢測的過程中很多因素都可能導致定量結果出現假陽性結果，影響結果的準確性。出現這一情況主要是因為PCR 方法的靈敏度較高，可能會對已經死亡的菌體進行擴增而導致的。另外，該檢驗方式的整體檢測成本較高，在實踐中進行大面積推廣還存在一定的難度。因此，如何快速有效鑒定各種致病菌，還有待于進一步研究和完善。

4 結語

總之，隨著生活水平的提高，在人們的生活中，對食品的質量安全的關注度也在逐漸增強。食品不僅僅是充當著人們營養的主要來源，還是關系到人們生活、工作、學習的重要角色。是消費者和全社會所共同認同和關注的問題之一。所以，對食品的安全監測對個人來說可以有效確保生活質量的不斷提高。而如果相關的檢測部門采用科學有效的方法，對各類食物進行認真檢測，就能夠從根本上保證食品衛生的安全。通過本文的分析也了解到，傳統的檢測方法耗時較長，準確性也偏低，無法滿足市場的需求。而應用實時熒光定量PCR 技術則能獲得更為理想的檢驗效果。為此，在今后的食品致病菌檢驗中，可以積極地嘗試對這一方法的推廣應用。