苦瓜枯萎病菌的產毒條件優化及發酵濾液特性

陳振東 秦健 郭元元 石延霞 謝學文 柴阿麗 李寶聚

摘要：為明確苦瓜枯萎病菌毒素產生的最佳發酵條件以及發酵濾液的特征特性，采用浸根法接種，研究病菌的產毒培養條件和發酵濾液的生物活性、穩定性等基本性質。結果表明，苦瓜枯萎病菌產毒的最適液體培養基、振蕩培養時間、裝液量分別為 Czapek 培養液、14 d、100 mL（250 mL 三角瓶）;病菌毒素發酵濾液對紫外光（36 μW·cm-2 ）、太陽光（2800～10 000 lx）、高溫高壓（121 ℃，0.11 MPa）、強堿（pH 12）和強酸（pH 3）穩定性好，致萎指數分別為95.83%、97.22%、97.22%、95.83%和 91.67%。病菌毒素發酵濾液對黃瓜、甜瓜、西瓜、冬瓜、瓠瓜和絲瓜等葫蘆科蔬菜作物幼苗生長均有致萎作用。綜上所述，苦瓜枯萎病菌毒素具有較好的穩定性，且對瓜類作物具有普遍的致萎作用。

關鍵詞：苦瓜枯萎病菌;毒素;發酵濾液;生物活性

中圖分類號：S642.5

文獻標志碼：A

文章編號：1673-2871（2022）03-016-05

Abstract： In order to determine the best toxin-producing condition， characteristics and biological activity of fermentationfiltrate from Fusarium oxysporum f. sp. momordicae（FOM）strain， we screened the culture medium of toxin productionof FOM with the root-dipping method， investigated the basic properties such as bioactivity and stability of fermentationfiltrate. The results showed that the optimal liquid medium， vibration culture time and liquid medium loading volume fortoxin-producing were Czapek medium， 14 d and 100 mL liquid medium in 250 mL conical flask， respectively. The toxinfermentation filtrates were stable to ultraviolet（36 μW·cm-2）， sunlight（2800-10 000 lx）， high temperature and high pres sure（121 ℃， 0.11 MPa）， strong alkali（pH 12）and strong acid（pH 3）， and the wilting indexes were 95.83%， 97.22%，97.22%， 95.83%， 91.67%， respectively. The toxin fermentation filtrate also caused wilt on other cucurbits seedlings，including cucumber， melon， watermelon， wax gourd， bottle gourd and loofah. In conclusion， the toxin of FOM had goodstability and caused wilting on cucurbit crops.

Key words： Fusarium oxysporum f. sp. momordicae; Toxin; Fermentation filtrate; Biological activity

枯萎病是苦瓜栽培過程中的一種重要病害，由尖孢鐮刀菌苦瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp.momordicae）病菌感染引起[1]，該病害在廣西苦瓜栽培主產區的發病率為 12.30% ～56.75%[2]，危害嚴重。枯萎病菌侵染過程中可產生致毒物質，對植株有顯著的損傷作用。病原菌侵染植物導致發病的有毒代謝物包括酶、毒素、激素等物質。其中，毒素是病原物的次生代謝物，可分為寄主選擇性毒素[3]和非寄主選擇性毒素[4]。由鐮刀菌產生的非寄主選擇性鐮刀菌毒素，能抑制寄主植物細胞的正常生理功能，通過破壞細胞結構使寄主出現中毒癥狀[5-7]。病原菌產生毒素的能力在不同的種屬間乃至專化型間的差異較大[8-10]，而同一菌株產生毒素的能力往往又直接受到不同的 C 源和 N 源營養條件、光照、溫度、pH 值、培養時間和方式等外界條件的影響[11-13]。胡忠亮等[14]以香石竹幼苗為研究對象，發現溫度 25～30 ℃，培養時間 15 d，在 PSC 培養液中，全天振蕩培養最有利于尖孢鐮刀菌產毒，且在強酸、強堿和高溫下具有較強的穩定性;胡穎慧等[13]研究發現尖孢鐮刀菌唐菖蒲專化型在 Czapek 培養基中培養 15 d 產生的濾液毒性最強，該濾液經 121 ℃滅 菌 20 min 后對唐菖蒲胚根仍有很強的抑制作用;臺蓮梅等[15]研究認為最適宜大豆根腐病菌生長及產生毒素的培養液為 PSC 培養液，連續振蕩培養以及光照有利于病菌產毒，而 pH 值對產毒影響不大。唐樹戈等[8]研究發現玉米彎孢葉斑病菌的毒素粗提液在高溫、低溫和光處理后其生物活性不受影響，具有良好的穩定性。

苦瓜枯萎病菌是尖孢鐮刀菌對苦瓜致病的一種專化型病菌，其產生毒素的規律以及培養基和營養成分對其產生毒素的影響、病菌毒素發酵濾液特性鮮有報道。本試驗以苦瓜幼苗為主要測試對象，研究苦瓜枯萎病菌的產毒培養條件，通過測定苦瓜枯萎病菌毒素濾液對苦瓜幼苗的毒力活性、穩定性及基本性質，明確不同營養成分的培養基和培養條件對苦瓜枯萎病菌毒素發酵濾液毒力的影響，找出有利于毒素產生的培養條件，為分離純化苦瓜枯萎病菌的毒素并鑒定其物質成分、探索病害的致病機制以及加速抗病品種選育打下基礎。

1 材料與方法

1.1 病菌來源及供試品種

供試的苦瓜枯萎病菌株 Fom3506 來自廣西農業科學院蔬菜研究所，經鑒定為尖孢鐮刀菌苦瓜專化 型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）病 菌。供測試的作物品種有：大直瘤油綠苦瓜桂農科三號（Momordica charantia）;黃色薄皮橙肉哈蜜瓜桂蜜 12 號（Cucumis melo var. Reticulates）、華北型密刺黃瓜桂青 1 號（Cucumis sativus L.）、淺綠皮有棱絲瓜桂絲 2 號（Luffa acutangula Roem.）、圓柱形黑皮冬瓜桂蔬一號（Benincasa hispida Cogn.），均來自廣西農業科學院蔬菜研究所;墨綠皮西瓜黑美人（Citrullus lanatus var. vulgaris）來自珠海市農之友種子有限公司;淺綠皮短身瓠瓜（Lagenaria sicerar ia var. clavata），來自廣州市蔡遠種子店;所有測試品種均為適宜華南地區種植的早中熟品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 病菌毒素發酵液制備 試驗于 2019 年 3—10 月在廣西蔬菜育種與新技術研究實驗室進行。將供試菌株 Fom3506 轉至 PDA 培養基上，于 28 ℃下活化 7 d，沿菌落邊緣打出直徑為 7 mm 的菌塊，將菌塊接入裝有 100 mL 培養液的 250 mL 三角瓶中，每瓶接 3 塊，共 6 瓶，在黑暗、28 ℃、120 r·min-1條件下振蕩培養。培養 14 d 后取樣，每次取 3 瓶。培養液先用 4 層紗布過濾，濾液在 3400 r·min-1下離心 20 min。棄去沉淀，上清液煮水中保持 20 min，得到毒素培養液原液，保存于 4 ℃冰箱，備用。

1.2.2 毒素濾液生物活性測定 將供試的苦瓜種子先用清水清洗，經 0.3%次氯酸鈉進行表面消毒10 min 后，用無菌水沖洗干凈置于網兜內，清水中浸泡 24 h，再置于 30 ℃恒溫培養箱內保濕催芽，種子露白后播種至 50 孔穴盤（540 mm×270 mm×50 mm）滅菌基質中。待苦瓜幼苗長至 2 葉 1 心時，用浸根法接種，將苦瓜幼苗放入裝有 8 mL 病菌液體培養濾液的 10 mL 玻璃試管中。每個重復 6 株， 3 次重復，設培養液和無菌水作對照，放置在光照16 h、濕度 90%下栽培生長，48 h 后調查植株萎蔫情況，并計算萎蔫指數。

參考莊敬華等[16]的植株萎蔫分級標準：0 級，葉面無癥狀;1 級，25%以下的葉面積有輕微萎蔫;2 級，25%～50%的葉面積萎蔫失水;3 級，50%以上葉面積萎蔫失水;4 級，全株萎蔫死亡。萎蔫指數（WI）=∑（病級株數×萎蔫級數）/（試驗總株數×最高萎蔫級數）×100。

1.2.3 病菌產毒條件篩選 產毒培養液毒力檢測。分別配制 PS、Czapek 和 Richard 三種培養液， 按 1.2.1 的方法制備病菌毒素發酵濾液，按 1.2.2 的方法測定病菌不同培養液的毒素發酵濾液對苦瓜幼苗的致萎活性。

產毒培養時間測定。將菌塊接入裝有 100 mLCzapek 培養液的 250 mL 三角瓶中振蕩培養，分別于培養 5、8、11、14、17 d 后取樣，按 1.2.2 的方法測定不同培養時間的毒素發酵濾液的生物活性。

裝液量對毒素發酵濾液毒力的影響測定。在250 mL 三角瓶中分裝 Czapek 培養液，設裝液量為40、60、80、100、120 mL 共 5 個處理，接入菌塊振蕩培養，14 d 后取樣，按 1.2.2 的方法測定不同含量培養液的毒素發酵濾液對苦瓜幼苗的致萎活性。

毒素發酵濾液穩定性測定。以未經處理的病菌毒素發酵濾液為對照，按 1.2.2 的方法測定 Cza-pek 培養液病菌毒素發酵濾液在不同逆境條件下處理后對苦瓜幼苗的致萎活性。將發酵濾液經加壓蒸汽高溫（121 ℃，0.11 MPa）處理 20 min，冷卻至室溫 ，測定其熱穩定性 ，每個處理 3 次重復。用 1 mol·L-1 HCl 和 1 mol·L-1 NaOH 將發酵濾液的 pH值分別調至 3 和 12，室溫下靜置 1 h 后，將 pH 值調回 7，測定其耐酸堿性，每個處理 3 次重復。將濾液分別放置于紫外燈（36 μW·cm-2）下 10 cm 處和太陽光（2800～10 000 lx）下敞口照射 1 h，測定其光穩定性，每個處理 3 次重復。

1.2.4 毒素發酵濾液對葫蘆科蔬菜幼苗的生物活性 以 1.1 的瓜類作物為測試對象，待幼苗長出 2片真葉后，按照 1.2.2 方法測定病菌毒素發酵濾液對不同作物的致萎活性。

1.3 統計分析

試驗數據采用 Microsoft Excel 2007、DPS 7.05軟件進行處理和統計分析，采用 Duncan's 多重比較法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同培養液對苦瓜枯萎病菌產毒的影響

不同培養液及其病菌毒素發酵濾液對苦瓜幼苗的致萎活性存在較大差異（表 1）。3 種培養液的病菌毒素發酵濾液對苦瓜幼苗均有抑制作用。其 中，Richard 培養液的病菌毒素發酵濾液的抑制作用最強（WI 為 100%），其次為 Czapek 培養液（WI 為98.61% ），PS 培 養 液 的 抑 制 作 用 最 小（WI 為 8.33%），可見 Richard 培養液和 Czapek 培養液均有利于病菌產毒。但是，未接菌種的 Richard 培養液對苦瓜幼苗產生明顯的生長抑制作用（WI 達到30.56%），而未接菌種的 Czapek 培養液對苦瓜幼苗生長影響微弱（WI 為 1.39%）;未接菌種的 PS 培養液對苦瓜幼苗生長沒有影響;未接菌種的 Czapek培養液和 PS 培養液對苦瓜幼苗生長的影響無顯著差異。結果表明，Czapek 培養液更適合作為苦瓜枯萎病菌產毒培養液。

2.2 培養時間對病菌產毒能力的影響

苦瓜枯萎病菌 Czapek 培養液在振蕩條件下設定的 5 個不同培養時間處理，發現毒素發酵濾液對苦瓜幼苗的致萎能力存在顯著差異（表 2）。病菌培養 5 d 時，毒素發酵濾液對苦瓜幼苗的平均萎蔫指數已達 70%以上。隨著病菌培養時間的延長，毒素發酵濾液對苦瓜幼苗的致萎能力不斷增強，培養至14 d 時平均萎蔫指數最高，達到 98.61%，顯著高于其他處理。當培養時間為 17 d 時，發酵濾液對苦瓜幼苗的致萎能力有所下降。以上結果說明，在 Cza pek 培養液中連續振蕩 14 d 是苦瓜枯萎病菌的最佳發酵時間，其產毒能力最強，毒素培養濾液致萎活性最高。

2.3 裝液量對病菌產毒能力的影響

病菌在 Czapek 培養液的 5 種裝液量下培養，其毒素濾液對苦瓜幼苗的毒性差異顯著（表 3）。隨著裝液量的增加，萎蔫指數表現為先上升后降低。當裝液量為 100 mL 時濾液萎蔫指數最高，達到93.06%，顯著高于其他處理，而裝液量為 120 mL 時濾液的萎蔫指數下降至 83.33%，說明在 250 mL 三角瓶中的裝液量為 100 mL 時病菌毒素發酵濾液的毒素濃度最大。

2.4 病菌毒素發酵濾液的穩定性

光照、強酸、強堿、高溫高壓對病菌毒素發酵濾液的毒力有一定的影響，但是所有處理的平均萎蔫指數仍然在 91%以上（圖 1）。太陽光（2800～10 000 lx）和紫外光（36 μW· cm-2）下處理病菌毒素發酵濾液1 h 后，萎蔫指數分別為 97.22%和 95.83%，且與未經處理的病菌培養濾液相比未達差異顯著水平，說明病菌毒素發酵濾液對光照具有穩定性。強堿（pH=12）處理病菌濾液 1 h 后，萎蔫指數為 95.83%，與未經處理的病菌培養濾液相比未達差異顯著水平。強酸（pH=3）處理 1 h 后平均萎蔫指數下降至91.67%，較未經處理的病菌培養濾液下降 7.04%，與未經處理的病菌培養濾液相比達到差異顯著水平;強酸處理的萎蔫指數較強堿性處理下降 4.16%，說明病菌毒素發酵濾液在強酸下的穩定性比強堿下稍弱，但強酸處理與強堿處理相比未達顯著差異水平，與其他處理相比均未達極顯著差異水平。病菌毒素發酵濾液經高溫高壓（121 ℃，0.11 MPa）處理20 min 后，濾液的萎蔫指數降低了 1.41%，與病菌培養濾液相比未達差異顯著水平，表明病菌毒素發酵濾液在高溫高壓下具有較好的穩定性。綜上可見，強酸處理對病菌培養液濾液致病力的穩定性影響較大。

2.5 毒素發酵濾液對不同葫蘆科作物幼苗的毒力

苦瓜枯萎病菌 Czapek 毒素發酵濾液對 7 種葫蘆科蔬菜作物幼苗都有強烈的致萎作用（圖 2）。所有作物的萎蔫指數均達到 94%以上。其中，黃瓜、甜瓜、冬瓜和絲瓜的萎蔫指數達 100%，顯著高于瓠瓜、西瓜和苦瓜的萎蔫指數。未接種病菌的 Czapek培養液對不同葫蘆科蔬菜作物幼苗也有一定的致萎作用，黃瓜、甜瓜、西瓜和冬瓜的幼苗出現不同程度的萎蔫（WI 為 12.50%～33.33%），但是對苦瓜幼苗的影響很小（WI 為 2.78%），而對絲瓜和瓠瓜幼苗無致萎作用。

3 討論與結論

培養液種類、培養時間和培養液裝液量等是影響微生物發酵的重要因子[15]，研究微生物的發酵條件優化及其特征特性對于深入研究微生物的濾液成分和開發利用其有效活性的代謝物具有重要意義[17]。不同 C 源和 N 源及含有其他營養成分的液體培養基對不同病原物的菌絲生長、孢子濃度和產毒量存在較大的影響，對病菌開展產毒培養液種類的篩選是十分有必要的。本研究發現，苦瓜枯萎病菌毒素發酵的最適培養液為 Czapek 培養液，這與西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）、香 蕉 枯 萎 病 菌（Fusarium oxysporum f. sp. cuben cuse）等病菌產毒的最適液體培養基相同[11- 12]。Richard 培養液也能促進苦瓜枯萎病菌產生較多的代謝產物，但是培養液本身對苦瓜幼苗的抑制作用較強烈，會影響試驗結果。而 PS 培養液促進苦瓜枯萎病菌產生代謝產物的能力較差，可能是由于缺少某些促進病原菌代謝必要的營養元素。本試驗中，苦瓜枯萎病菌在 Czapek 營養液中培養時間為14 d 以及裝液量為 100 mL（250 mL 三角瓶）時更加利于毒素代謝產物的形成，其發酵后的致萎活性最佳，可見發酵培養時間以及發酵裝置中氧氣含量等也是影響病原物毒素發酵效率的重要因素。

明確病菌發酵濾液的特征特性是研究其成分和開發應用發酵濾液的前提。本研究發現，苦瓜枯萎病菌毒素發酵濾液在紫外光（36 μW·cm-2）和太陽光（2800～10 000 lx）、高溫高壓（121 ℃，0.11 MPa）以及強酸（pH=3）和強堿（pH=12）下具有穩定性，這與胡穎慧等[13]、胡忠亮等[14]研究表明的研究結果相似，說明尖孢鐮刀菌毒素發酵濾液的成分具有較好的穩定性。

尖孢鐮刀菌苦瓜專化型（Fusarium oxysporumf. sp. momordicae）病菌具有很強的寄主選擇性，苦瓜是其主要寄主，瓠瓜是次要寄主[18-19]。本試驗中苦瓜枯萎病菌毒素發酵濾液對 7 種葫蘆科蔬菜作物幼苗都有顯著的致萎活性，說明該病菌的毒素發酵濾液對葫蘆科作物沒有寄主選擇性。

病菌培養濾液中的次生物質是導致不同作物幼苗萎蔫的關鍵因子，在生理濃度范圍內的非酶類毒素化合物可干擾植物正常生理功能[20-22]。常見的鐮刀菌毒素包括單端孢霉烯族毒素類（Trichothe-cenes）、伏 馬 毒 素（Fumonisins）、玉 米 赤 酶 烯 酮（ZEN）、鐮刀菌酸（FA）、白僵菌素（BEA）等[23-25]。苦瓜枯萎病菌的次生代謝物質是否也存在這些毒素化合物質，有待進一步研究。

綜上所述，苦瓜枯萎病菌毒素發酵的最佳培養液為 Czapek 培養液，最佳培養時間為 14 d、裝液量為 100 mL（250 mL）三角瓶。苦瓜枯萎病菌毒素發酵濾液在紫外光、太陽光、高溫高壓以及強酸和強堿下具有較好的穩定性，且該病菌毒素發酵濾液無寄主選擇性。

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