骨髓間充質干細胞濃度調節Treg/Th17表達的研究

阮鵬 曾毅 胡穎嵩

[摘要]目的探討骨髓間充質干細胞（BMMSCs）濃度對調節性T細胞（Treg）/輔助性T細胞17（Th17）表達的影響。方法貼壁法提取大鼠BMMSCs并傳代培養至P4代，油紅O染色法及鈣鹽染色法測定P3代成脂及成骨誘導能力。倒置顯微鏡下標記CD29、CD90、CD45熒光抗體。磁珠法分選大鼠CD4+T細胞，流式細胞儀測定細胞純度。將CD4+T細胞與濃度不同的BMMSCs（0.5倍、1倍、2倍、4倍濃度組）共培養3 d，流式細胞儀測定Treg、Th17增值比例，流式微球分析法檢測轉化生長因子-β（TGF-β）及白介素（IL-6、IL-10、IL-17）水平。結果本研究P4代BMMSCs形態均勻，且呈梭形緊密排列，成脂誘導后鏡下呈現橘紅色脂肪小滴，成骨誘導后鏡下呈現黑鈣鹽結節。CD90、CD29于BMMSCs表面陽性表達，CD45弱表達。磁珠法分選出CD4+T細胞約（5.75±0.36）×10個/ml，細胞純度>95%。共培養后，在Treg增殖比例上，2倍>1倍>0.5倍>4倍濃度組，2倍濃度組與其他各組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。在Th17增殖比例上，1倍>2倍>0.5倍>4倍濃度組，0.5倍濃度組與各組組間比較，4倍濃度組與1倍、2倍濃度組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。在TGF-β水平上，1倍>2倍>4倍>0.5倍濃度組，1倍濃度組與0.5倍、4倍濃度組組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。在IL-10水平上，2倍>1倍〉4倍〉0.5倍濃度組，0.5倍濃度組與其他各組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。在IL-6、IL-17水平上，各組組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論BMMSCs具多向分化潛能，CD4+T細胞分化成Treg、Th17的增殖比例受到BMMSCs濃度的影響，較高濃度時增殖效應最強，高濃度時抑制增殖，兩者增殖比例變化與相關因子表達水平并不同步。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞;調節性T細胞;輔助性T細胞17;濃度調節

[中圖分類號]R329.2??? [文獻標識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）05-0031-05

Study on the regulation of Treg/Th17 expression by the concentration of bone marrow mesenchymal stem cells

RUAN Peng1??? ZENG Yi1??? HU Yingsong2

1. Inspection Department，Wuhan Zhongtong Lanbo Medical Laboratory Co.，Ltd，Hubei，Wuhan 430000，China;

2. Department of Laboratory Medicine，Hubei Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Hubei，Wuhan 430000，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of the concentration of bone marrow mesenchymal stem cells （BMMSCs）on the expression of regulatory T cells （Treg）/ T helper 17 cells （Th17）. Methods Rat BMMSCs were extracted by adherence culture method and subcultured to P4 generation，and the lipogenic and osteogenic induction potential of P3 generation was determined by oil red O staining and calcium salt staining. CD29，CD90 and CD45 fluorescent antibodies were labeled under inverted microscope. Rat CD4+ T cells were sorted by magnetic bead method，and cell purity was determined by flow cytometry. CD4+ T cells were co-cultured with BMMSCs of different concentrations （0.5x，1x，2x，and 4x）group for 3 d. Treg and Th17 value-added ratios were determined by flow cytometry，and the levels of transforming growth factor-β（TGF-β）and interleukin （IL-6，IL-10，IL-17）were measured by cytometric bead array. Results In this study，BMMSCs of P4 generation were uniform in morphology and closely arranged in a shuttle shape，showing small fat droplets in tangerine microscopically after lipogenic induction and black calcium salt nodules microscopically after osteogenic induction. CD90 and CD29 were positively expressed on the surface of BMMSCs and CD45 was weakly expressed. CD4+ T cells were sorted out by magnetic bead method at about （5.75±0.36）×10 cells/ml，with cell purity>95%. After co-culture，the ratio of Treg proliferation was：2x>1x>0.5x>4xconcentration group，with the 2xconcentration group significantly different from all other concentration groups，with statistically significant differences （P<0.05）. The ratio of Th17 proliferation was：1x>2x>0.5x>4xconcentration group，with the 0.5x concentration group significantly different from all other concentration groups，and the 4xconcentration group significantly different from 1x and 2x concentration groups，with statistically significant differences （P<0.05）. The level of TGF- pwas：1x>2x>4x>0.5xconcentration group，with the Ixconcentration group significantly different from 0.5xand 4xconcentration groups，with statistically significant differences （P<0.05）. The level of IL-10 was：2x>1x>4x>0.5x concentration group，with the 0.5x concentration group different from all other concentration groups，with statistically significant differences （P<0.05）. There were no statistically significant differences in the levels of IL-6 and IL-17 among each group （P>0.05）. Conclusion BMMSCs have multi-lineage differentiation potential，and the proliferation ratio of CD4+ T cells differentiated into Treg and Th17 is affected by the concentration of BMMSCs，with the strongest proliferative effect at relatively high concentrations and inhibition of proliferation at higher concentrations，and the changes in the proliferation ratios of Treg and Th17 are not synchronized with the expression levels of related factors.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells;Regulatory T cells;T helper 17 cells;Concentration regulation

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是存在于骨髓，具有多向分化性及自我增殖能力的一種非造血來源干細胞[1]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在調節免疫細胞增殖、表面受體表達、相關因子分泌等方面具有不可或缺的作用[2]。調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）和輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）是分別具有抗炎和促炎作用的兩類初始CD4+T細胞亞群[3]。Treg/Th17動態平衡是介導自身免疫耐受、維持移植微環境穩態的重要機制，而以Th17為主導的比例失衡及IL-17等，則可致自身免疫病、炎癥、移植排斥、腫瘤、代謝異常等的發生[4-5]。根據既往研究，MSCs對Treg/Th17有調控作用。本研究將不同濃度的大鼠BMMSCs同CD4+T細胞共培養，探討BMMSCs濃度對Treg/Th17表達的影響，以期為BMMSCs在不同條件下的臨床運用提供參考。

1??? 材料與方法

1.1??? 實驗動物

選取SPF級雄性Wistar大鼠[武漢大學動物實驗中心，許可證號SCXK （鄂）2008-0004]。在3周齡、約50 g的實驗大鼠中提取BMMSCs，選6周齡、約200 g的實驗大鼠分選CD4+ T細胞。本實驗符合《實驗動物管理條例》，且獲武漢大學動物實驗倫理委員會審批。

1.2??? 實驗材料

青霉素鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司，SV30010），Von Kossa染色試劑盒（北京博蕾德生物科技有限公司，HTKMS1001-1），轉化生長因子-β（TGF-β）檢測試劑盒（上海滬震實業有限公司，HZ-TGF-B1-Mu），胎牛血清（美國Gibco公司，12676029），DMEM/F12 培養基（美國Gibco 公司，12634010），倉鼠抗小鼠CD29 PE （美國BD公司，562801），小鼠抗大鼠CD45 PE-Cy7（美國BD 公司，561588），CD90 APC熒光抗體（上海恪敏生物科技有限公司，SZB17840），IL-6檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL14113），IL-10檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20242-96T），IL-17檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，ZN2653），抗大鼠CD4 FITC熒光抗體[上海艾博抗貿易有限公司，ab269349），大鼠CD4磁珠（德國Melitenyi 公司，130-049-201 ），CO2 培養箱[上海一恒科學儀器有限公司，BPN-50CH（UV）]，流式細胞儀（美國BD公司，FACSCanto II）等。

1.3??? 方法

①提取BMMSCs：剖取3周齡實驗大鼠的脛、股骨，將骨髓腔反復洗滌后留取懸液并接種于T75 培養瓶，加入DMEM/F12完全培養液（含1%青霉素鏈霉素雙抗+10%胎牛血清）5 ml后置于培養箱孵育，2～3 d換液1次。貼壁法分離純化BMMSCs 至90%融合。傳代培養至P4代后于倒置顯微鏡下觀察形態并標記CD29、CD90、CD45熒光抗體。流式細胞儀檢測細胞純度。②油紅O染色法檢測P3代成脂誘導能力：倒去培養液后，先以磷酸鹽緩沖液輕緩漂洗，再加入95%酒精固定胞膜30 min，稀釋油紅儲存液，濾紙過濾并靜置，除去雜質，染色30 min，75%酒精脫色，除去多余染料，封片。③鈣鹽染色法檢測P3代成骨誘導能力：漂洗同上，加入冷丙醇固定胞膜10 min，蒸餾水沖洗數次，置入孵育液孵育4～6 h，沖洗，2%硝酸鉆浸泡4 min，沖洗數次，1%硫化銨浸泡2 min，沖洗，自然干燥、封固。④提取CD4+T細胞：獲取6周齡大鼠的脾單個核細胞懸液，計數后將CD4+ T細胞磁珠按比例加入并混勻，將其孵育后置入MS分選柱，緩沖液反復沖刷后獲取CD4+T細胞并計數。流式細胞儀檢測細胞純度。⑤共培養：BMMSCs以不同濃度[0.5/1/2/4倍濃度（1/2/4/8×10個/孔）]+培養液置于6孔板孵育。2 d后加入CD4+T細胞（2×10個/孔）及IL-2 （50 mg/L）、植物血凝素（5 g/L），孵育3 d后離心提取上清并冷凍保存。⑥Treg、Th17及相關因子檢測：流式細胞儀檢測Treg及Th17增殖比例。流式微球分析法檢測TGF-B、IL-10、IL-17、IL-6 水平。

1.4??? 統計學方法

2??? 結果

2.1??? 細胞形態學結果

倒置顯微鏡下P4代BMMSCs形態均勻，且呈梭形緊密排列，符合實驗要求所需。經成脂誘導后鏡下呈現橘紅色脂肪小滴。經成骨誘導后鏡下呈現黑鈣鹽結節。見圖1 ～ 3。

2.2??? BMMSCs表面抗原檢測結果

CD90、CD29于細胞表面陽性表達，CD45弱表達，符合實驗要求所需，見圖4。

2.3??? CD4+ T細胞鑒定

磁珠法分選出CD4+T細胞約（5.75±0.36）×10個/ml，見圖5。細胞純度>95%。符合實驗要求所需。

2.4??? BMMSCs濃度對Treg/Th17表達的影響

共培養后，在Treg增殖比例上，2倍>1倍>0.5倍>4倍濃度組，2倍濃度組與其他各組組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。在Th17增殖比例上，1倍>2倍>0.5倍>4倍濃度組，0.5倍濃度組與各組組間比較，4倍濃度組與1倍、2倍濃度組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6～7。

2.5??? BMMSCs濃度調節Treg/Th17表達對相關因子水平的影響

共培養后，在TGF-B水平上，1倍>2倍>4倍>0.5倍濃度組，1倍濃度組與0.5倍、4倍濃度組組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。在IL-10水平上，2倍>1倍>4倍>0.5倍濃度組，0.5倍濃度組與其他各組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。在IL-6、IL-17水平上，各組組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3??? 討論

BMMSCs在幼稚CD4+T細胞的增殖、分化中意義重大，Treg與Th17是其中影響較大的兩類細胞[6]。兩者均于TGF-B信號的調控下完成初始分化，但于終末分化階段，Treg在細胞核內分泌TGF-B、IL-10等抑炎因子，介導免疫逃逸，保持免疫穩態;Th17分泌IL-17、IL-6等致炎因子，誘導自身免疫及炎癥反應[7]。既往研究[8-9]亦證實，Treg/Th17比例及其相關細胞因子失衡與某些疾病的發生及其病情程度顯著相關。

BMMSCs具有多項分化潛能。本研究提取大鼠BMMSCs與CD4+ T細胞，觀察顯示，BMMSCs形態均勻，且呈梭形緊密排列，成脂誘導后鏡下呈現橘紅色脂肪小滴，成骨誘導后鏡下呈現黑鈣鹽結節。說明BMMSCs增殖旺盛，且具有成脂及成骨分化潛能。來源于骨髓、羊水、脂肪等組織中的MSCs 一般可在其表面陽性表達CD90、CD73、CD29等，弱表達CD14、CD45等。本研究BMMSCs表面陽性表達CD90、CD29，弱表達CD45，CD4+T細胞純度>95%。證明所得細胞符合實驗所需。

本研究共培養后，在Treg增殖比例上，2倍>1倍>0.5倍>4倍濃度組，2倍濃度組與其他各組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。在Th17增殖比例上，1倍>2倍>0.5倍>4倍濃度組，0.5倍濃度組與各組組間比較，4倍濃度組與1倍、2倍濃度組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。在TGF-β水平上，1倍>2倍>4倍>0.5倍濃度組，1倍濃度組與0.5倍、4倍濃度組組間比較，差異有統計學意義（P <0.05）。在IL-10水平上，2倍>1倍>4倍>0.5倍濃度組，0.5倍濃度組與其他各組比較，差異有統計學意義（P <0.05）。在IL-6、IL-17水平上，各組組間比較，差異無統計學意義（P >0.05）。提示BMMSCs可促進Treg、Th17的增殖、分化，但其濃度梯度與Treg/Th17增殖比例不呈正相關。具體表現為，低濃度（0.5倍）時，兩者即可增殖，且Th17增殖高峰稍早于Treg;較高濃度（1倍、2倍）時，兩者增殖效應最強，高倍濃度（4倍）時，兩者增殖比例均顯著降低，起抑制作用。而在Treg/Th17平衡對相關因子表達的影響上，相關因子水平與Treg/Th17增殖比例的變化并不同步，且IL-6、IL-17水平變化并不顯著。這可能與TGF-B、IL-10等抑炎因子在BMMSCs調節下顯著增殖有關[10]。

BMMSCs免疫調節的發揮是多機制的，除TGF-B/Smad 信號通路，Toll受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路在先天免疫細胞的激活中亦具重要地位，其可通過自身TLR-3、TLR-4的激活誘導CD4+ CD25+T細胞特征性表達FoxP3蛋白使Treg表達上調，進而發揮免疫抑制作用，當TLR 基因沉默，則分化受抑[11]。此外，TLR亦在不同條件或病模下對Th17分化產生影響。李凌云[12]敲除心臟移植小鼠TLR2基因的研究表明，敲除TLR2可上調Th-17、IL-17、IL-6表達，加重小鼠排異反應。張皓旻等[13]的研究指出，TLR可通過Th17信號通路誘使TNF、IL-6等細胞因子表達上調及自身抗體生成以介導自身免疫應答等。Najar等[14]對BMMSCs的研究中，Treg增殖時，IL-10水平隨之上升。Kim等[15]在Th0與BMMSCs的培養體系中阻斷IL-10信號通路，結果顯示Th17及IL-17比例升高。以上研究共同提示，BMMSCs調節Treg/Th17 平衡機制的實現，可能與其促進Treg及其相關因子增殖、抑制Th17及其相關因子分泌有關。

綜上，BMMSCs具多向分化潛能，CD4+T細胞分化成Treg、Th17的增殖比例受到BMMSCs濃度的影響，較高濃度時增殖效應最強，高濃度時抑制增殖，兩者增殖比例變化與相關因子表達水平并不同步。

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